多肽合成方法有哪些

多肽合成方法有什么？~

现在，人们已经发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构域功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要的信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。

二、合成方法

多肽的合成主要有两种途径：化学合成和生物合成。化学合成主要通过氨基酸缩合反应来实现。为得到具有特定顺序的合成多肽，当合成原料中含有官能度大于2的氨基酸单体时，应将不需要反应的基团暂时保护起来，然后再进行连接反应，以保证合成的定向进行。多肽的化学合成有固相合成和液相合成，其主要的区别在于是否使用固相载体。多肽液相合成主要有逐步合成和片段组合两种策略，

细胞因子模拟肽利用已知细胞因子的受体从肽库内筛选细胞因子模拟肽，近年成为国内外研究的热点。国外已筛选到了人促红细胞生成素，人促血小板生成素，人生长激素、人神经生长因子及白细胞介素等多种生长因子的模拟肽，这些模拟肽的氨基酸序列与其相应的细胞因子的氨基酸序列不同，但具有细胞因子的活性，并且具有分子量小的优点。这些细胞因子模拟肽正处于临床前或临床研究阶段。抗菌性活性肽当昆虫受到外界环境刺激时产生大量的具有抗菌活性的阳离子多肽，已筛选出百余种抗菌肽，体内外实验证实，多个抗菌肽不仅有很强的杀菌能力还能杀死肿瘤细胞。[1]例如，从蚕体内筛选的抗菌肽D表现了很好的应用前景，并能利用基因工程技术生产。蛇毒内也存在多种活性多肽，从蛇毒内分离出一个13个氨基酸(INKAIAALAKKLL)小肽，其对G+及G-菌均有杀菌能力。用于心血管疾病的多肽很多植物中药有降血压、降血脂、溶血栓等作用，不仅可用作药物，亦可用作保健食品。但由于其作用成份不能确定，其应用受到很大限制。现已发现很多有效成分是小分子多肽，比如我国科学家从大豆内加工分离出的活性多肽，可通过小肠直接吸收，能防治血栓，高血压和高血脂，还能延缓变老，提高肌体抗肿瘤能力。从人参、茶叶、银杏叶等植物内也分离出很多用于心血管疾病的小肽。其它药用小肽小肽药物除在上述几大方面已取得较大进展外，在其它很多领域也取得一些进展。比如Stiernberg等发现一个合成肽(TP508)肽能促进伤口血管的再生，加速皮肤深度伤口的愈合。Pfister等发现一个小肽(RTR)4能防止碱损伤角膜内炎症细胞的侵润，抑制炎症反应。Carron等证实其筛选的2个合成肽能抑制破骨细胞对骨质的重吸收。

多肽合成方法：

1. 酰基叠氮物法

   早在1902年，Theodor Curtius就将酰基叠氮物法引入到肽化学中，因此它是最古老的缩合方法之一。在碱性水溶液中，除了与酰基叠氨缩合的游离氨基酸和肽以外，氨基酸酯可用于有机溶剂中。与其他许多缩合方法不同的是，它不需要增加辅助碱或另一等当量的氨基组分来捕获腙酸。  

   长期以来，一直认为叠氮物法是唯一不发生消旋的缩合方法，随着可选择性裂解的氨基酸保护基引入，该方法经历了一次大规模的复兴。该方法的起始原料分别是晶体状的氨基酸酰肼或肽酰肼64,通过肼解相应的酯很容易得到。在－10℃的盐酸中，用等当量的亚硝酸钠使酰肼发生亚硝化而转化为叠氮化物65,依次洗涤、干燥，然后与相应的氨基组分反应。有些叠氮化物可用冰水稀释而沉淀出来。 二苯磷酰基叠氮化物（DPPA）也可以用于酰基叠氮化物的合成。Honzl-Rudinger方法采用亚硝酸叔丁作为亚硝化试剂，并且使叠氮缩合反应可在有机溶剂中进行。因酰基叠氮化物的热不稳定性，缩合反应需在低温下进行。当温度较高时，Curtius重排，即酰基叠氮转化为异氰酸酯的反应成为一个主要的副反应，最终导致生成副产物脲。由于反应温度低（如4℃）而导致反应速率相当慢，使得肽缩合反应通常需要几天才能完全。  对于较长的N端保护的肽链，酯基的肼解一般比较困难，因此，使用正交的N保护肼衍生物是一种选择。在肼基的选择性脱除后，按倒接（backing-off）策略组合的肽片段可以用于叠氮缩合。

   如前所述，虽然叠氮法一直被认为是消旋化倾向最小的缩合方法，但在反应中，过量的碱会诱发相当大的消旋。因此，在缩合反应期间要避免与碱接触，例如，氨基组分的铵盐应采用N，N－二异丙胺或N－烷基吗啉代替三乙胺来中和。  

   虽然有上述局限性，但该方法仍很重要，尤其对于片段缩合而言，因为该方法具有较低的异构化倾向，适用于羟基未保护丝氨酸或苏氨酸组分时，Nˊ保护的本行酰肼还具有多种用途。

2. 酸酐法

   在多肽合成中，最初考虑应用酸酐要追溯到1881年Theodor Curtius对苯甲酰基氨基乙酸合成的早期研究。从氨基乙酸银与苯甲酰氯的反应中，除获得苯甲酰氨基乙酸外，还得到了BZ-Glyn-OH(n=2-6)。早期曾认为，当用苯甲酰氯处理时，N－苯甲酰基氨基酸或N－苯甲酰基肽与苯甲酸形成了活性中间体不对称酸酐。  大约在70年后，Theodor Wieland利用这些发现将混合酸酐法用于现代多肽合成。目前，除该方法外，对称酸酐以及由氨基酸的羧基和氨基甲酸在分子内形成的N－羧基内酸酐（NCA,Leuchs anhydrides）也用肽缩合。最后应该提到，不对称酸酐常常参与生化反应中的酰化反应。

3. 混合酸酐法

   有机羧酸和无机酸皆可用于混合酸酐的形成。然而，仅有几个得到了广泛的实际应用，多数情况下，采用氯甲酸烷基酯。过去频繁使用的氯甲酸乙酯，目前主要被氯甲酸异丁酯所替代。

   由羧基组分和氯甲酸酯起始形成的混合酸酐，其氨解反应的区域选择性依赖依赖于两个互相竞争的羰基的亲电性和（或）空间位阻。在由N保护的氨基酸羧酸盐（羧基组分）和氯甲酸烷基酯（活化组分，例如源于氯甲酸烷基酯）形成混合酸酐时，亲核试剂胺主要进攻氨基酸组分的羧基，形成预期的肽衍生物，并且释放出游离酸形式的活性成分。当应用氯甲酸烷基酯（R1＝异丁基、乙基等）时，游离的单烷基碳酸不稳定，立即分解为二氧化碳和相应的醇。然而，对于亲核进攻的区域选择性，也有一些相反的报道，产物为氨基甲酸酯和原来的N保护氨基酸组分。  为了形成混合酸酐，将N保护的氨基酸或肽分别溶于二氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、乙酸乙酯或DMF中，用等当量的三级碱（N－甲基哌啶、N－甲基吗啉、N－乙基吗啉等）处理。然后，在－15℃－－5℃，剧烈搅拌的同时加入氯甲酸烷基酯以形成不对称酸酐（活化）。经短时间活化后，加入亲核性氨基酸组分。如果作为铵盐使用（需要更多的碱），必须避免碱的过量使用。如果严格按照以上的反应条件，混合酸酐法很容易进行，是最有效的缩合方法之一。

4. 对称酸酐法

   Nα－酰基氨基酸的对称酸酐是用于肽键形成的高活性中间体。与混合酸酐法相反，它与胺亲核试剂的反应没有模棱两可的区域选择性。但肽缩合产率最高，为50%（以羧基组分计）。 

   虽然由对称酸酐氨解形成的游离Nα－酰基氨基酸可以和目标肽一起，通过饱和碳酸氢钠溶液萃取回收，但在最初，这种方法的实用价值极低。对称酸酐可以用Nα－保护氨基酸与光气，或方便的碳二亚胺反应制得。两当量的Nα－保护氨基酸与－当量的碳二亚胺反应有利于对称酸酐的形成，对称酸酐可以分离出来，也可不经纯化而直接用于后面的缩合反应。基于Nα－烷氧羰基氨基酸的对称酸酐对水解稳定，可采用类似上述纯化混合酸酐的方法进行纯化。  

   由于Boc-保护氨基酸的商品化和合理的价格，在肽链的逐步延长中，使用对称酸酐法日益受到重视。虽然可以买到晶状的对称酸酐，但原位制备仍然是一种不错的选择。

5. 碳二亚胺法

   碳二亚胺类化合物可用于氨基和羧基的缩合。在该类化合物中N，Nˊ－二环己基碳二亚胺（DCC）相对便宜，而且可溶于肽合成常用的溶剂。在肽键形成期间，碳二亚胺转变为相应的脲衍生物，N，Nˊ－二环己基脲可以从反应液中沉淀出来。显然，碳二亚胺活化后的活性中间体氨解和水解速率不同，使肽合成能在含水介质进行。经几个课题组的大量研究，确立了以碳二亚胺为缩合剂的肽缩合反应机理，羧酸根离子加成到质子化的碳二亚胺，形成高活性的O－酰基脲；虽然还没有分离出这个中间体，但通过非常类似的稳定化合物推断了它的存在。O－酰基脲与氨基组分反应，产生被保护的肽和脲衍生物。或者，与质子化形式处于处于平衡状态的O－酰基异脲,被第二个羧酸酯亲核进攻，产生对称的氨基酸酐和N，Nˊ－二取代脲。前者与氨基酸反应得到肽衍生物和游离氨基酸。在碱催化下，使用DCC的副反应使酰基从异脲氧原子向氮原子转移，产生N－酰基脲71,它不再发生进一步的氨解。不仅过量的碱可催化O－N的酰基转移，而且碱性的氨基组分或碳二亚胺也可催化该副反应。 

   另外，极性溶剂有利于这一反应途径。

多肽的目前常用的是固相化学合成。其他的方式目前使用较少
一、固相合成多肽的聚合物载体及连接分子
1.聚合物载体 固相合成多肽需要有固相载体及连接固相与反应物的连接分子,正确选择载体和连接分子决定着固相合成法的成功。固相合成多肽用的载体多数采用聚苯乙烯及二乙烯基苯和苯乙烯共聚物等高聚物的衍生物,如氯 树脂、Pam树脂、王氏树脂和氨基树脂等。载体树脂的溶胀状况对缩合试剂及羧基组分的自由扩散,对肽链之间的聚集等与缩合反应有关的因素有明显影响。为了使载体有较好的溶胀性,且有较大的网络空间足以容纳不断增长的较长的肽链,而且便于反应物进入载体的内部,一般均采用1%～2%交联度的聚苯乙烯珠状树脂或微孔树脂。
2.连接分子 固相合成多肽曾经使用过键合不同连接分子的聚合物,这些连接分子为含有氯甲基、巯甲基、酰氯基、对苯甲酰基、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二酰基、邻硝基苄醇基及二苯氯硅烷等的双官能团化合物。一个理想的连接分子必须在整个合成过程中十分稳定,并在合成后可以定量的切割下来而又不破坏合成的目标分子。选择适合的连接分子还应根据与树脂相连的肽的C末端的结构类型,裂解后生成相应的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物。
二、固相合成多肽的检测
即使是高效的偶联技术,也不能保证酰化反应100%地进行。而且,当遇到立体障碍或Β2片层等序列时,偶联反应的效率更大大下降。聚合物载体上总是有缺序或截序的多肽链,在解脱时,它们也进入到产物中,给分离带来很大困难。因此,固相合成肽时,尤其是较长的肽时,每一个氨基酸的缩合率应该达到99.9%,否则得到的产物将非常不纯。因此,监测每一步反应的进行过程显得格外重要。（杭州专肽生物有着20余年的固相合成经验，通过固相合成技术可以满足绝大多数客户的需求）
1 定性颜色反应 茚三酮显色法(Kaiser法),是用茚三酮 颜色反应快速测定树脂上的氨基,从而判定酰化反应是否完全。用茚三酮法检测聚苯乙烯树脂氨基的灵敏度可达到 5μmol/g。这样的灵敏度已可检测出缩合反应是否进行了99%以上。茚三酮检测时,由于末端氨基酸残基及序列不同, 出现的颜色强弱不同。天门冬氨酸(Asp)、天门冬酰胺(Asn)会产生很弱的蓝色或淡棕色。生色试剂2,4,62三硝基苯磺酸与树脂上氨基反应显示橙红色,灵敏度为5μmol/g树脂。
Kaiser试剂包括：
A，6%茚三酮的乙醇溶液
B，80%苯酚的乙醇溶液
C，2%0.001MKCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后，重蒸后再使用。检测过程，取少量树脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加热1-2min，如果溶液有兰色，或树脂出现兰色，红褐色，表明还有游离氨基，否则说明连接完全。还有其它检测游离氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬兰法等。
2 定量自由氨基检测 水杨醛法,用于接肽后树脂上残余氨基的量以及去除保护基后总氨基量的测定,可以定量地检测缩合反应以及脱除保护基的反应是否完全。如不完全即可及时反复处理。用2%水杨醛+6%吡啶的乙醇溶液同树脂上的氨基反应(60℃,30～35分钟),洗净后,再用5%苄胺乙醇溶液将水杨醛置换下来(60℃,30分钟),加苄胺的乙醇溶液稀释后,读315nm的光吸收值,计算氨基的量(Ε=4.36× 103)。此法对于—NH2在0.15μmol/mg树脂以上的样品的相对偏差在5%以内。
3 HPLC检测部分保护的中间肽 在多肽合成中间,取少量的肽树脂(3～10mg)进行裂解,乙醚沉淀,溶于适当溶剂中直接进行HPLC分析。裂解时肽的N-端保护基根据需要保留或脱除。当合成的肽是较短的极性肽时,可以保留保护基团,否则,在HPLC中保留时间太短,不利于分析。这个方法虽然比较麻烦,但所需时间较短,精确度较高。
三、反应溶
二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)是肽固相合成中常用的溶剂,尤其是DMF对作用物和产物均具有溶解度高的优点而被广泛应用于多种反应系统中。虽然, DMF有更好的溶解度,但沸点较高,需要减压才能蒸去。而 且,副产物N-酰基脲在高介电常数的溶剂〔DMF,甲氰 (CH3CN),二甲亚砜(DMSO),H2O等〕中容易生成,而在低介 电常数的溶剂(CH2Cl2,CCl4,C6H6等)中比较不容易生成。在非极性溶剂中,N-保护氨基酸能与DCC很快地反应生成对称酸酐。因此,只要反应物能够溶解,应尽可能选用低介电常数的溶剂。在固相合成中,绝大多数都是采用DCM为溶剂,它比选用DMF为反应溶剂有消旋率小和N-酰基脲形成较慢两点好处。在遇到羧基组分不易溶解时,可加数滴重蒸DMF助溶。
四、缩合试剂主要有：碳二亚胺型，鎓盐型（Uronium）
碳二亚胺型
主要包括：DCC，DIC，EDC.HCl等。采用DCC进行反应，由于反应中生成的DCU，在DMF中溶解度很小，产生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其价格便宜，在液相合成中，可以通过过滤除去，应用仍然相当广泛。EDC.HCl因为其水溶解性的特点，在多肽与蛋白的连接中使用比较多，而且也相当成功。但是该类型的缩合试剂的一个最大的缺点，就是如果单独使用，会有比较多的副反应，但是研究表明如果在活化过程中添加HOBt，HOAt等试剂，可以将其副反应控制在很低的范围。
鎓盐型
鎓盐型缩合试剂反应活性高，速度快，现在使用非常广泛，主要包括：HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。该试剂使用过程中需要添加有机碱，如，二异丙基乙胺（DIEA），N-甲基吗啉（NMM），该试剂加入后，才能活化氨基酸。
五、固相合成过程
1、羟基树脂为载体的合成方法（Wang树脂为例：图1）
Wang树脂、PAM树脂、HMPA树脂、Sasrin树脂等均在Linker结构中含有苄醇基。多数情况下把预制的N一保护氨基酸的对称酸酐及催化剂DMAP(对二甲氨基吡啶)与羟基树脂一起反应。在这种成键反应中。DMAP是必需的，但也由此带来一些麻烦。例如，当某些位阻较大、反应活性较低的Fmoc-氨基酸需要较长的反应时间，而且DMAP的纯度又不理想时。会发生部分Fmoc基被脱除，生成部分二肽的麻烦。更常见的危险是当Cys及His作为C端第一个氨基酸与羟基树脂反应时，DMAP往往使这两种氨基酸发生消旋化。对此，解决办法是改用Cl-Trt树脂与这两种氨基酸键合，同样可以生成酯型Linker。另一种解决办法是用MSNT试剂[Fra I388, Ren 1998]，可以有效地免除Cys,His与多种羟基树脂键合时的消旋化危险。
2.以三苯甲基树脂树脂为载体的合成方法（图2）
三苯甲基(trt)树脂含有三重苄基结构，因此反应活性极高。一般用等摩尔量的保护氨基酸及4倍量的DIEA与Trt树脂混在二氯甲烷中，室温反应30-12Omin即达完全。对于未反应完全的位点，可用甲醇封住位点。基于Trt Linker的温和键合及温和裂解特点，在此种树脂上进行肤片段缩合及全保护基肤片段制备是较理想的方式。
3以氨基树脂为载体的合成方法
MBHA树脂、PAL树脂、Knorr树脂、Rink-NH2树脂等均在Linker中含有可与羧酸反应的氨基。C端第一个氨基酸与之键合的反应条件与接肽循环中的操作完全相同。如果以DCC为缩合剂，一般先将N-保护氨基酸与DCC、HOBT混于溶剂(DMF、THF、DCM等)中，生成氨基酸的HOBT活泼酯，放置3-5h，待活化反应基本完全后滤除副产物DCU沉淀，把羧基活化组分溶液与氨基树脂混合进行键合反应。此步反应有两点事项值得注意:①多数氨基树脂的氨基并非以游离状态出售。有的氨基是以盐酸盐的形式，有的则带有临时保护基(如Fmoc , Boc等），因此在与C端第一个氨基酸键合之前必须进行相应的中和或脱除临时保护基的处理;②氨基酸活化组分的用量应大大高于氨基树脂组分，一般的摩尔比为（2-5）：1，目的是使键合反应接近100% ,因为未被酰化的氨基树脂无法从产物中清除出去。使用大大过量的构件是所有固相有机合成的共同之处。
除了DCC之外，其他常见的缩合剂还有DIC、EDC、EEDQ、HBTU等.

多肽合成总的来说分成两种：固相合成和液相多肽合成。
多肽合成是一个固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。多肽合成总的来说分成两种：固相合成和液相多肽合成。

多肽准确名称是生物活性肽，是20世纪被发现的。多肽有生物活性多肽和人工合成多肽两种。生物提取的多肽具有很强的活性，所以叫做活性肽!只有活性的肽才能对人体产生很好的效果!但是人工合成的多肽有很多是没有活性的，是需要筛选的，只有活性肽才能被人体安全使用! 活性肽是人体极其重要的活性物质，不夸张的说，它的增减对人类的生.老.病.死.具有极其的重要性! 想了解这方面的知识的话，可以去生物帮啊，那里提供最新、领先、精准、高效、全面的生物产品和技术信息，可以找到多肽方面的介绍的，看看 www.bio1000.com/zt/protein/100606.html 会有帮助的。

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