如何使用液相色谱

高效液相色谱使用步骤~

如何使用高效液相色谱(HPLC)

现在一般说的就是高效液相色谱（HPLC），原理如下文，但具体的操作就要看具体的仪器了，因为国内外的不同厂家生产的操作方案可能有所不同，而且你去面试要使用HPLC的话建议你最好先去找台能使用的熟悉下，毕竟这玩意的价格不是一般的。而有些普通的液相色谱就很简单了，只要你看懂了原理就能进行操作，没有什么特别的难度。

液相色谱法简介

气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论与技术，在70年代初建立了高效液相色谱分析法（以HPLC表示）。在常压下操作的液相色谱，分离一个样品往往长达几小时至几十小时，因此工作效率很低。人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压的办法来提高流速，以缩短分离时间，但是结果失败了。根据液相色谱理论，因为随着载液（流动相）流速的提高，板高则增大，所以柱效会显着降低。随着生产技术的提高，人们制成了细小（<10μm）而高效的填充物，从而使柱效大大提高。但是随着填充物粒度的减小，柱压降显着增大，为了得到合理的载液流速，使用了高压；输液泵，使流速达到1～10mL/min。从而使分析一个多组分样品只需几分钟到几十分钟时间。随着高效固定相、高压泵和高灵敏度检测器以及电子技术和计算机技术的应用，70年代以业逐步实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和自动化操作。因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱，以区别于经典液相色谱。高效液相色谱法的分类与经典液相色谱法一致。按固定相的聚集状态不同分为液固色谱法和液液色谱法。按分离原理不同分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱法四类。

高效液相色谱所用基本概念：

保留值等色谱分析有关术语，以及分配系数、分配比、塔板高度、分离度、选择性等方面均与气相色谱相一致；高效液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率理论也与气相色谱一致。因液相色谱以液体代替气相色谱中的气体作流动相，则速率议程H=A+B/?+C?。式中：纵向扩散项（分子扩散项）B/?对板高的影响与气相色谱不同，由于液相色谱中组分分子在流动相中的扩散系数Dm仅为气相色谱中的万分之一，因此纵向扩散项对板高的影响可以忽略不计。于是影响液相色谱的主要因素是传质项Cu。由图14—可知，气相色谱（GC）的流动相流速u增大时，板高H显着增大（即柱效显着降低），而液相色谱（LC）的流速增大时，板高增大不显着（即柱效降低不显着）。这说明高效液相色谱也有很高的分离效能，此外，气相色谱的载气权数种，其性质差别也不大，对分离效果影响也不大。而液相色谱的载液种类多，性质差别也大，对分离效果影响显着。因此流动相的选择很重要，并且在选择流动相对应注意以下几点：流动相对样品有适当的溶解度，但不与样品发生化学反应，也不与固定液互溶；流动相的纯度要高（至少分析纯）、粘度要小，以免带进杂质和组分在流动相中扩散系数下降；流动相应与所用检测器相匹配，不应对组分检测产生干扰作用。高效液相色谱不但具有高效、高速、高灵敏度的特点，还由于它的流动相（载液）种类比气相色谱的流动相（载气）多，因此可选用两种或多种不同比例的液体作流动相，从机时可提高选择性。此外，液相色谱的馏分比气相色谱易于收集。便于为红外、核磁等方法确定化合物结构提供纯样品。由于高效液相色谱法具有以上特点，它适于分离、分析沸点高、热稳定性差、分子量大（大于400）的气相色谱法不能或不易分析的许多有机物和一些无机物，而这些物质占化合物总数的75～80%。因此它已广泛用于核酸、蛋白质、氨基酸、维生素、糖类、脂类、甾类化合物、激素、生物碱、稠环芳烃、高聚物、金属螯合物、金属有机化合物以及多种无机盐类的分离和分析。但是，高效液相色谱的固定相的分离效率、检测器的检测范围以及灵敏度等方面，目前还不如气相色谱法。此外对于气体和易挥发物质的分析方面也远不如气相色谱法，因此高效液相色谱法和气相色谱法配合使用可互相取长补短，相辅相成。

1.分离原理
凝胶色谱，又称空间排阻色谱。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻滞作用也不同而进行分离、分析的方法。凝胶色谱的分离要理和其它色谱法不同，它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千埃。色谱柱内填充具有一定大小孔穴的凝胶。当样品进入色谱柱后，不同大小的样品分子（图14—2中以黑点表示）随流动相沿凝胶颗粒（图14—2中以空心圈表示）外部间隙和凝胶孔穴旁流过，体积在的分子因不能渗透到凝胶孔穴里而得到排阻，因此较为顺利地通过凝胶柱而较早地被流动相冲洗出来。中等体积的分子产生部分渗透作用，小分子可渗透到凝胶孔穴里去而受阻滞，因有一个平衡过程而较晚地被流动相冲洗出来。这样，试样组分基本上按分子大小受到不同阻滞而先后流出色谱柱，从而实现分离目的。光凝胶色谱采用水溶液作流动相进，称为过滤凝胶色谱（HFC），而用有机溶剂为流动相时，称为凝胶渗透色谱（GPC）。

2．固定相
凝胶色谱的固定相凝胶，是含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，是一种经过交联而具有立柱网状结构的多聚体。根据凝胶的交联程度和含水量的不同，分了软质、半硬质和硬质三种。软质凝胶（如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等）交联度低，膨胀度大，容量大，可压宿，不能用于高压（使用压力低于3.5kg/㎝2或更低），主要用于含水体系的常压凝胶色谱，半硬质凝胶（如苯乙烯一二乙烯基苯交联共聚凝胶），容量中等，渗透性较高，压力可用到70kg/㎝2。适用于非水溶剂流动相；硬质凝胶（如多孔硅胶、多也玻球等），膨胀度小，不可压缩，渗透性好，可耐高压，适于高流速下操作。

3．流动相
在凝胶色谱中，为提高分率效率，多采用低粘度、与样品折光指数相差大的流动相。常用的流动相有苯、甲苯、邻二氯苯、二氯甲烷、1，2一二氯乙烷、氯仿、水等。

色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的:在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素(植物叶的提取液)的石油醚倒入管中。此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。
但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析。
操作规程
一、液相色谱要放置在平稳牢固的台面上。
二、液相色谱要有可靠的接地。
三、高压气瓶要放置在阴凉、通风处，通过减压阀和机器连接。
四、使用氢火焰时，应先开助燃气，后开氢气，关闭时应先关氢气，后关助燃气。注意检查氢瓶、减压 阀、连接管线是否泄漏，如有泄漏应立即处理。
五、温控设备，压力表应按规定进行检定。
六、仪器工作室，应放置足够数量的消防器材。

1． 电源准备
打开稳压器电源开关，须待电压指示至 220V 后，才能开启其他有关设备。
2．LC-600高效液相色谱仪的准备
试剂：三氟乙酸
乙腈
超纯水（Millipore 超纯水）
冰乙酸
溶液配置：贮液瓶与流动相的准备
A 液 0.1%三氟乙酸 （三氟乙酸 1ml，超纯水 999ml）室温保存
B 液 60%乙腈 （乙腈 600ml， 超纯水 400ml）室温保存
样品液 0.01%乙酸 （冰乙酸 10 　 l 超纯水 100ml）室温保存
泵头冲洗液：精滤后超纯水或者是 1%色谱纯甲醇 室温保存
注：贮液瓶应用超纯水淌洗干净，备用。
流动相溶剂用洁净 G4 玻沙漏斗精滤除去微小颗粒（目前未滤过溶液）。
操作者必须清楚并注明 A、B 贮液瓶盛装为何种溶剂。
冲 洗 泵 头 ： 用 注 射 管 于 软 塑 料 管 末端 抽 吸 至 有 水 流 出 ， 调 节 流 速 开 关 控 制 流 速 为20-30drop/min.（
① 流动相管道排气
如果，管道中气泡较多，可通过弹击管道，排除气泡，并逆时针旋转脱气泵活塞使其松动，用注射管于流动相出口的塑料管末端抽吸至管道内气泡排除完全。操作时，我们通常已经打开了脱气机（气泡严重影响分离效果，所以观察管道中液体是否有气泡非常重要。）
② 开机
③ 进入LC-600高效液相色谱仪操作系统
④ 数据记录的终止与保存
3． 关机
1）N2000色谱工作站的关闭
在 N2000的主操作界面上分别单击关闭泵、检测器图标，或通过菜单关闭。关闭电脑主机及显示器。将所有使用仪器用布盖好。关闭排气扇、空调与稳压器开关。
2） 清洁卫生
实验完毕后，打扫仪器室桌面与地面清洁，保持桌面整洁。
3） 仪器使用记录
记录当天的仪器使用情况于指定记录本上，包括仪器使用起止时间与出现问题的解决方案，并签上操作者的名字.以上为－－-液相色谱仪的使用方法

现在一般说的就是高效液相色谱（HPLC），原理如下文，但具体的操作就要看具体的仪器了，因为国内外的不同厂家生产的操作方案可能有所不同，而且你去面试要使用HPLC的话建议你最好先去找台能使用的熟悉下，毕竟这玩意的价格不是一般的。而有些普通的液相色谱就很简单了，只要你看懂了原理就能进行操作，没有什么特别的难度。

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章仇磷霉： 1、先查找你需要分析样品的分析方法:波长,流动相类型,流动相比率,流量,色谱柱规格型号等分析条件; 2、根据分析条件准备好流动相试剂,连接色谱仪; 3、开机预热,设定检测器波长,设定泵的流量,梯度分析还要设定梯度比率和时间程序; 4、启动泵,开始置换试剂;打开工作站,查看基线情况; 5、基线稳定后,可以进样分析

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章仇磷霉：[答案] 准备好流动相(比如甲醇和水),开机(开泵,检测器,有柱温箱和自动进样器的也一同打开),开工作站,设定流动相比例和流量,设定检测波长,然后启动泵,等基线平稳后即可进样了. 老弟你好相一点不懂呀,最好找一个明白人现场给你操作...

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章仇磷霉： 1、开机前的准备:打开实验室空调,根据样品的检测条件和色谱柱的条件配置所需淋洗液和再生液. 2、开机:依次打开打印机、计算机进入操作系统;打开氮qi钢瓶总阀,调节钢瓶减压阀分压表指针为0.2MPa左右,再调节色谱主机上的减压表指针为5psi左右,确认离子色谱仪与及计算机数据线连接正常,打开离子色谱主机电源;点击开始、程序、Chromeleon、sever monitor、双击桌面上工作站程序、双击安装目录下离子色谱操作控制面板;操作控制面板打开后选中connected使软件与离子色谱仪联动起来,打开泵头废液阀排除泵和管路里的气泡,关闭泵头废液阀,开泵启动仪器,查看基线,待基线稳定后方可进样分析

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章仇磷霉： 一.开机程序1.打开氮气总阀,拧紧分压阀.2.打开稳压电源和色谱仪开关.3.启动计算机,运行软件,调用预先编辑好的控制方法,下载到色谱仪.4.待柱箱温度达到控制方法设定的初始值后,测量柱流量:在皂膜流量计里加入几滴检漏液...

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珠海市19147543830： 液相色谱(物理分离技术) - 搜狗百科？
章仇磷霉： 气相色谱仪主要用来分析气相样品和易挥发的热稳定样品,如弱极性小分子有机物;而液相色谱主要用来分析高沸点或若不稳定样品,如核酸等.在购买设备时厂家一般会附赠一个介绍仪器使用方法的说明书,里面有一些样品使用该仪器的分析方法,没有的话可以像厂家索要.另外,通过查阅文献或根据经验也可以大致了解参数设定方法.还可以用相关软件计算出所需参数.