酶联免疫吸附测定实验（ELISA）的操作流程，谢谢大家

酶联免疫吸附测定的方法类型和操作步骤~

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。该法适于测定细胞培养上清、血清、血浆及组织液中的样本，干扰小可以测到每毫升纳克水平的细胞因子（或受体）的水平。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）用脱脂奶粉或BSA进行封闭。洗涤除去多余的脱脂奶粉或BSA。（3）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。（4）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。（5）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色.

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 　 http://www.bio1000.com/zt/dna/201562.html 质粒提取,质粒载体,质粒基本特性,质粒构建,质粒载体的构建及应用,质粒提取方法原理,质粒提取注意事项,质粒载体结构，生物帮上面有详细的介绍。

　　Elisa 操作流程（以人IL-4 ELISA KIT为例）：
　　检测原理:
　　本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会 与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色 的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可 通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。
　　试剂盒组成：
　　1．抗体预包被酶标板（8×12 或 8×6）
　　2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支）
　　3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml）
　　4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支）
　　5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
　　6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支）
　　7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
　　8．浓缩洗涤液 20× （白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml）
　　9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
　　10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
　　11．封板胶纸（6/3 张）
　　12．产品说明书（1 份）
　　标本收集:
　　1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
　　2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。
　　3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。
　　4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。
　　5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建 议做预实验，以确定稀释倍数)。
　　注意事项:
　　1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。
　　2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁 或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。
　　3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后 再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。
　　4. 若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。避免反复冻 融。
　　5. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。
　　6. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
　　7. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。
　　8. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否则将影响试 验结果。
　　9. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标本时， 请按国家生物试验室安全防护条列执行。
　　检测前准备工作:
　　1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。
　　2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放回4℃。
　　3. 标准品: 加入标准品/标本稀释液0.5ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为1000 pg/ml)。然后根据需要进行稀释。(建议标准曲线使用以下浓度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。复溶标准品原液（1000 pg/ml）若未用完请分装后放入-20℃以下电冰箱内保存，保存两个月。已稀释的标准品请废弃。
　　4. 生物素化抗体工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:30)成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致生物素化 抗体量不足，可向我们公司单独购买生物素化抗体。（须提供抗体批号）
　　5. 酶结合物工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以酶结合物稀释液稀释浓 缩酶结合物(1:30) 成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致浓缩酶结合物量不足， 可向我们公司单独购买浓缩酶结合物。（须提供酶结合物批号）
　　洗涤方法:
　　1. 自动洗板机：要求注入的洗涤液为350ul，注入与吸出间隔15－30秒。洗板5次。
　　2. 手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350ul，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。

　　操作步骤:
　　1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条，密封口袋，放回4℃。
　　2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。
　　3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。
　　4．洗板5次。
　　5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。
　　6．提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 ) ℃ 放置。
　　7．洗板5次。
　　8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。
　　9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
　　10．洗板5次。
　　11．加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。
　　12．加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。
　　13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。
　　建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。

　　结果判断:
　　1. 每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值。
　　2. 手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
　　3. 若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

　　灵敏度、特异性和重复性:
　　● 灵敏度：最小可测人IL-4达7pg/ml。
　　● 特异性：不与IL－1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反应。
　　● 重复性：板内，板间变异系数均<10%。

（1） 加入50uL的标准品或样品于所设定的孔中；
（2） 在每孔中加入100uL一抗， 轻轻摇动微孔板混匀1分钟；
（3） 室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟；
（4） 洗板3次，每次加入250uL 1×洗液，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干；
（5） 每孔加入150uL1×二抗（避免阳光直射和工作台温度过低，孵育时适当覆盖微孔板）；
（6） 室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟；
（7） 洗板3次，每次加入250uL1×洗液，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干；
（8） 加入100uL的TMB底物（底物本身无色，出现颜色变化不能使用）；
（9） 室温（22.5±2.5）°C避光孵育孵育10-15分钟，加入100uL的终止液终止反应，在450nm下读OD值(读数前使用无绒布擦拭微孔底部水分和指模)。

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沙坡头区15754005873： 酶联法是什么 - ？
邲琳通塞： 酶联免疫法,简称ELISA.它的中心就是让抗体与酶复合物结合,然后通过显色来检测.步骤其实很简单:ELISA用血清来检测,首先血液要经过至少半个小时的凝集,然后取血清(这是有些网友不理解为什么医院抽完了血对血置之不理的原因...

沙坡头区15754005873： 酶联免疫吸附试验的基本原理是什么啊也就是Elisa - ？
邲琳通塞：[答案] 说穿了是利用抗体结合的专一性 将容易检测的酶先连接到抗体上 通过抗体的与目标蛋白的结合来定位目标蛋白 目标蛋白>... 生产上也更加方便 目标蛋白>--一级抗体>--二级抗体联上酶 根据实验具体需要还可以进行灵活的调整 因而有不同的elisa设计 ...

沙坡头区15754005873： 什么是酶联免疫诊断试剂?？
邲琳通塞： ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒) (以下简称ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)) :是酶免疫测定技术中应用最广的技术.其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除.常用的 ELISA(酶联免疫吸附试验)法有双抗体夹心法和间接法,前者用于检测大分子抗原,后者用于测定特异抗体.

沙坡头区15754005873： Elisa是什么意思? - ？
邲琳通塞： Elisa:酶联免疫吸附试验,是将抗原抗体反应特异性和酶的高效催化作用相结合而发展起来的一种免疫检测技术,既可用于抗原的检测,又可以由于抗体的检测.根据检测方法的不同可分为双抗体夹心法,间接竞争法.像深圳三方圆这方面不错.水产品的孔雀石绿是农业部唯一备案的.像

沙坡头区15754005873： 什么是艾滋检测的酶联法?？
邲琳通塞： 艾滋检测的酶联法全名是酶联免疫吸附试验.酶联法是检测艾滋病的一种固相免疫测定技术,先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.这种方法也被简称为ELISA.

沙坡头区15754005873： 酶联免疫检测试剂盒是干什么的 - ？
邲琳通塞：[答案] 酶联免疫吸附试验 (简称ELISA) :是酶免疫测定技术中应用最广的技术.其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除.常用的 ...

沙坡头区15754005873： 酶联免疫吸附测定(ELISA)检测的原理及优点是什么? ？
邲琳通塞： 原理:酶联免疫吸附测定的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记.结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫...

沙坡头区15754005873： 酶联免疫吸附法elisa是什么意思 - ？
邲琳通塞： 是酶免疫测定技术中应用最广的技术.其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面

沙坡头区15754005873： 什么叫ELISA法 - ？
邲琳通塞： 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法,即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) .ELISA已成为分析化学领域中的前沿课题 ,它是一种特殊的试剂分析方法,是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 .

沙坡头区15754005873： ELISA是什么意思？
邲琳通塞： 酶联免疫吸附测定的意思