蛆虫疗法的实验研究

蛆虫疗法的疗法历史~

蝇的幼虫——蛆对感染创口的清洁作用很早就引起人们的注意。在十六世纪中叶就已发现感染创面上孳生的蝇蛆非但不会加重感染，反而有利于愈合。在19世纪，拿破仑的军队里使用这个方法为受伤的士兵治疗，并且将这个方法推广到了美国内战和第一次世界大战时期。20世纪40年代，抗生素的出现使得蛆治疗法被遗弃，用蛆治病成了一种简陋而不科学的土方法。在美国和欧洲一些国家蛆疗被广泛应用于各种化脓性感染的创面，包括：脓肿、烧伤、坏疽和慢性腿部溃烂，取得了良好的临床效果，临床治疗率达80%。21世纪，由于滥用抗生素导致耐药菌出现，新一代医生开始减少对抗生素的使用，重新青睐自然生物疗法，又使蛆虫疗法回到了人们的视线。国内王江宁教授于1998年将此疗法引入国内，并应用于临床获得成功，严重软组织感染合并全身中毒症状的病人可以不用截肢，既保全了生命又避免了截肢。中央电视台《走进科学》节目两次报道了该疗法的有效性。该项研究分别于于2004年、2010年两次获得国家自然基金资助；于2009年获得北京首都医学特色项目资助，从分子水平揭示了生物清创的本质及蛆虫抗菌肽的分子结构及生物合成，为人类生物清创奠定更坚实的理论基础，2010年《生物清创的临床及实验研究》项目获得了北京市科技进步三等奖，生物清创的临床适应症主要为：糖尿病足、褥疮和创伤引起的软组织感染。

蛆虫疗法，指利用医用蛆虫帮助清理溃烂伤口，吃掉阻碍伤口复原的坏死组织和细菌的一种自然生物疗法。2011年12月，法国研究人员表示，蛆虫清理难以愈合的大型伤口的速度超过手术。

王江宁教授所获国家自然基金项目研究内容如下：
作用机理：
（1）蛆的分泌液能够破坏不健康或异常组织, 而对健康组织无损。由于蛆虫产生的胶原酶、类胰蛋白酶、类糜蛋白酶能将坏死组织分解成半液状泡沫, 然后进行消化，此外它们的分泌液含有抗微生物的抗菌酞。
（2）蛆虫能清除创面的细菌。它们有快速大量吞食消化细菌的能力。
（3）蛆虫能刺激伤口愈合。有人在实验中发现蛆虫蠕动的机械刺激能促使成纤维细胞产生胶原和纤维 蛋白, 加速肉芽组织的生成。
（4）蝇蛆分泌碱性物质，改变创面酸碱度。
（5）其他 活体蛆虫分泌物的抑菌作用研究
一、活体蛆虫的无菌处理
我们的方法是于喂养的2-3天取出蛆虫。先用生理盐水反复冲洗，将幼虫分别放在3.5%甲醛生理盐水溶液中5分钟；放入2%的双氧水溶液中3分钟；放入5%的碘仿溶液中；放入5%的含氯的消毒液中；放入75%的酒精中3分钟，不影响蛆的生活力。我们设计连续用以上浓度的甲醛、双氧水和含氯的消毒液对蛆进行处理，每次处理完毕后用蒸馏水洗涤，对消毒的蛆体表面经细菌和病毒学检验证实无细菌和病毒存在并且蛆的活力仍然存在，无菌状态可用于活体临床与基础实验。
二、活体蛆虫分泌物的获取
取适量蛆虫（600条），分为金葡菌诱导组（将300条幼虫与金葡菌共培养48小时）和对照组，分别加入2倍体积TNE缓冲液（10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ,150 mM NaCl, 5 mM EDTA,及蛋白酶抑制剂混合物含10µg/ml leupeptin,1µg/ml aprotinin,and 1mM PMSF,3mM Na3VO4）冰浴10min，充分匀浆匀浆液离心(12000Xg,4OC，10min) 取上清液，加3倍体积的TNE缓冲液，沸水浴2min离心(12000Xg, 4OC,10min)取上清液，即为粗提物。
三、抗菌物质生物活性测定方法的建立
细菌浓度及培养基对抑菌斑形成的影响：研究发现不同细菌浓度及培养基对抑菌斑的形成及菌斑大小有明显作用，经过选择我们使用能使抗菌物质产生最大抑菌斑的细菌浓度即5个OD值，30ul来铺平板，并用水解酪蛋白做为固体培养基便于纯化过程中更敏感地检测抗菌物质生物活性。 　不同细菌对于抗菌物质的抗菌敏感性比较：比较了两种不同细菌革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）对抗菌物质的抗菌敏感性，结果如图示
A，B，C：抗菌粗提物 A，D：抗菌粗提物 　E，F：幼虫匀浆上清液
E，C：幼虫匀浆上清液 D：TNE缓冲液 B：TNE缓冲液
四、总结
溃疡创面继发细菌感染是糖尿病足患者导致截肢的主要原因。抗生素治疗具有局部浓度高的优点，但局部应用容易导致细菌耐药，本实验中头孢哌酮对从临床分离培养出的金黄色葡萄球菌的抗菌作用较弱证明了这一点。昆虫具有特殊的免疫防御体系，多种昆虫受到外界有害刺激诱导时能产生体液免疫物质。苍蝇幼虫生活在病原微生物较多的环境中，但它自身则不得病，可见蝇体自身具有独特的免疫防御体系。实验中采集的蛆虫血淋巴分泌物提取液对金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌作用，其抗菌能力强于头孢哌酮。我们认为有害细菌在一定程度上起到了诱导作用，刺激蛆虫的机体防御体系产生抵抗这种细菌的物质。丝光绿蝇幼虫（蛆）主要生长在腐尸和腐烂的鱼肉等含有大量细菌的环境中,以腐败组织为食物，对有血运的活体组织无任何影响。国外一些学者利用丝光绿蝇幼虫的这一特性将其应用于感染创面的修复治疗中，取得良好效果。我们将具有活力的蛆虫虫体消毒处理后,对蛆虫体表经细菌和病毒学检验证实无细菌和病毒存在，将消毒的蛆虫用于糖尿病足部溃疡创面的临床治疗，所有病例创面脓性坏死组织清除干净,新鲜的肉芽组织迅速生长,创面表面培养无细菌。我们认为，蛆虫在溃疡创面上爬行，吞食脓性坏死组织、清洁创面的同时，环境中的金黄色葡萄球菌也进入蛆虫体内，刺激蛆虫机体产生某种抗菌蛋白物质，消灭细菌。 活体蛆虫分泌物促进糖尿病大鼠的创面愈合作用研究
一、材料与方法
1、糖尿病模型复制:3月龄雄性普通级SD大鼠,体重300～350g,购自大连医科大学实验动物中心。实验前12h禁食,定量。实验当日称体重,尾静脉采血，用血糖仪测定基础血糖，然后,给实验组30只75mg/kg注射链脲佐菌素(Sigma,临用前溶解在0 01mmol/L的枸橼酸缓冲液中,pH4 2),其余大鼠给予等剂量枸橼酸缓冲液腹腔注射。1周后当动物血糖浓度≥16.7mmol/L时,糖尿病模型复制成功。
2、创面模型制作:取上述人工复制的糖尿病大鼠20只和正常组大鼠10只,以5%盐酸氯胺酮注射液(50mg/kg)腹腔推注麻醉后,背部剃毛,常规消毒。在无菌条件下用特制打孔器在鼠背中部脊柱上下两处各打一圆孔,深至皮下,直径1.8cm,创面面积为2.54cm2。止血后以无菌纱布包扎,单笼喂养,定量饮水与喂食。所有实验均在清洁级动物实验室完成。
3、中药生肌膏配置：由生黄芪、炮甲、熟地、金银花、黄连等十五味中药组成，具有托里生肌、解毒化瘀之功效，由大连大学附属医院中药房提供。
4、实验分组：分为中药治疗组(TLSJ+DM)喂以中药生肌膏3ml/只/d；单纯蛆疗组(MDT+DM) 、正常对照组(NORM)和模型对照组(DM) 均喂以生理盐水 3ml/只/d。每日分别以蛆分泌物、生理盐水各1.5ml 湿敷中药治疗组，单纯蛆疗组创面，上部创面湿敷蛆分泌物、下部创面湿敷生理盐水。用无菌纱布覆盖，绷带包扎并固定。单笼喂养。每日定时换药 1 次至创面愈合。
二、观测指标
1、愈合标准：天平称重后换算成创面平面面积。测得的数据均用 x±s 表示，创面愈合标准为痂壳小于创面面积 5%或愈合面积≥95%为完全愈合。
2、病理学检查：术后 7、14、21 天取各组动物创面组织，10%福尔马林液固定标本，石蜡包埋切片后常规 HE 染色。
3、免疫组化：各组的 bFGF、CTGF 的水平于术后 7、14、21 天取各组动物创面皮缘，约 0.5×0.5cm2。用 SABC 免疫组化法分别检测组织切片后，切片用二甲苯、梯度酒精脱蜡至水，PBS（0.01M）洗3分钟 2 次，在室温下 3%H2O2孵育切片 15 分钟消除过氧化物酶，PBS 洗 3 分钟 2 次，微波炉抗原修复 100℃10 分钟，加动物血清封闭液封阻 10 分钟，倾去，37℃下加入稀释后的一抗工作液，4℃湿盒中过夜，PBS 洗 3 分钟 3 次，加生物素化二抗工作液，37℃湿盒中温育 20 分钟，度酒精脱蜡至水，以同上方法操作，PBS 洗 3 分钟 3 次，加 SABC 酶标，37℃湿盒中温育 20 分钟，PBS 洗 3 分钟三次，DAB 显色，镜下控制，显色完成后入 PBS 终止显色，流水冲洗 10 分钟，苏木素复染30 秒，流水返蓝 10 分钟，脱水，透明，封固，中性树胶封片。每张切片在10×20倍显微镜下随机选取创伤皮肤内的4个不重叠的视野，进行 bFGF 阳性表达细胞, CTGF 阳性表达细胞计数。
三、数据处理方法　以均数±标准差表示，同组治疗前后采用配对 t 检验，组间比较采用单因素方差分析，用 SPSS10.0 对数据进行统计分析。
四、结 果
1.一般观察：造模 1 周时，造模大鼠均出现饮水量、尿量、摄食量增多，并表现出反应迟缓和倦怠，毛色无光泽。实验结束时，正常对照组大鼠活泼好动，毛色光泽，摄食正常，创面基本自行修复。模型对照组大鼠全身明显消瘦及饮水量、尿量加重，创面渗出、糜烂严重，创面不断加大加深，其他情况无改善。中药治疗组大鼠毛色尚有光泽，体重及饮水量无明显减少，活动频率如常，摄食尚可，创面恢复如新。单纯蛆疗组大鼠毛色无光泽，活动较前稍有增加，创面恢复，但形成的皮肤组织较薄。中药治疗组明显优于模型对照组及单纯蛆疗组。血糖变化除正常对照组，其他各实验组各时间点,血糖值经单因素方差分析发现组间无显著性差异(P>0.05)， 所以可以不考虑各组间血糖值影响伤口愈合的因素。
2.创口面积及创面愈合时间变化：伤后模型组创面面积逐渐增大,并且伴有溃烂、渗出，大鼠死亡率较高。蛆分泌物组及托里生肌中药组早期创面愈合速度较慢,各组间无显著性差异 P>0.05;至伤后第 7～21日,两组创面明显缩小。
静脉性溃疡患者参与了此项新研究。在住院两周期间，研究人员随机挑选患者，分成两组，每组超过50人，一组接受蛆虫疗法，一组接受传统的手术刀清理伤口疗法。治疗时，两组患者均被蒙上眼睛，并不知道自己接受的是何种疗法。
治疗使用的蛆虫是丝光绿蝇幼虫，装在小瓶子里，治疗时放在患者伤口上，一周两次。蛆虫分泌的物质渗入伤口，溶解死亡的组织而后吃掉，在它们的内脏进行进一步降解。法国卡昂大学医学中心的安妮-多姆马丁博士和同事表示，两组患者在疼痛或者感受到的蠕动感方面没有差异。他们的研究发现刊登在《皮肤病学文献》上。
一周后，接受外科手术清理伤口的患者伤口处平均有三分之二的区域被腐肉覆盖，腐肉会阻碍伤口愈合。相比之下，接受蛆虫疗法的患者只有55%的伤口区域被腐肉覆盖。

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吉安县17869483690： 蛆虫疗法的实验研究有哪些? ？
枕物斯诺： 王江宁教授所获国家自然基金项目研究内容如下:作用机理:(1)蛆的分泌液能够破坏不健康或异常组织,而对健康组织无损.由于蛆虫产生的胶原酶、类胰蛋白酶、类...

吉安县17869483690： 蛆虫疗法的优势有哪些? ？
枕物斯诺： 医用蛆是指一种特殊蝇种(丝光绿蝇)的幼虫,医用蛆虫清创伤口既快又好.首都医科大学王江宁教授及454医院王爱萍医生临床研究证明,该疗法比传统方法更能有效地清除伤口腐肉,加快溃疡伤口的愈合,从而避免患者因肢体溃烂而进行截肢手术.蛆虫疗法治疗糖尿病、足溃烂、皮肤溃烂等有一定优势.蛆虫不会吃伤口周围健康的组织,只攻击创面上的坏死组织部分,不影响周围正常组织,并能促进肉芽组织的形成.它还可以进入到外科手术都难以到达的深部创面,它们在吞噬腐肉后的排泄物中含有杀菌的盐,体内还有抗生素和提高患者免疫力等有助于溃疡伤口愈合的物质.

吉安县17869483690： 蛆虫疗法的清理速度 - ？
枕物斯诺： 2011年12月22日,法国研究人员表示,蛆虫清理难以愈合的大型伤口的速度可能超过手术,例如糖尿病患者身上的伤口.

吉安县17869483690： 用蛆治疗伤口. - ？
枕物斯诺： 近年,由于抗菌素耐药菌株的大量出现,蛆虫治疗再次兴起.进入21世纪,随着人口的老年化,慢性创面如糖尿病足病、褥疮等逐年增多,人们需要更好的治疗方法,蛆虫治疗以其独特的优势而受到人们的青睐.随着新材料、新技术的发展,蛆虫治疗的许多缺点得以克服,使得人们使用更加方便.对蛆虫分泌物研究方面也取得了长足的进展.蛆虫分泌物对感染性创面愈合有效.直接用蛆治疗的是这类伤口而不是新鲜伤口.

吉安县17869483690： 蚂蝗主要的作用是? - ？
枕物斯诺： 蠕动不止的蛆和吸血水蛭可以说是令人感觉恶心吧?可是这些看起来令人讨厌的东西却可以用来治病.生物疗法曾一度盛行,后来由于科技 的进步这些土方法慢慢就被弃之不用了,在科技十分发达的今天,专家们又开始关注生物疗法,相关的研...

吉安县17869483690： 医用蛆虫是干什么用 - ？
枕物斯诺： 主要就是利用蛆虫只吃腐肉的特性一些病人身体局部腐烂人工技术是无法完全 去除腐肉而不伤害到好的肌肤利用蛆虫的这个特性 这个医学难题就决绝了 不要小看蛆虫的作用比如腐烂的位置在静脉附近 切除怕割开了静脉 不切除早晚就会出问题这时蛆虫就是最好的选择

吉安县17869483690： 蝇咀有什么功效? - ？
枕物斯诺： 蛆虫疗法,指利用医用蛆虫帮助清理溃烂伤口,吃掉阻碍伤口复原的坏死组织和细菌的一种自然生物疗法.2011年12月,法国研究人员表示,蛆虫清理难以愈合的大型伤口的速度超过手术 蛆~富含高蛋白~牛肉味,噶本脆.MD刚才百度了下图片,现在头皮还很麻~~~

吉安县17869483690： 蛆可治病? - ？
枕物斯诺： 当然可以用蛆来治病.只不过一般情况下医院不敢用,病人及家属也不能接受.伤口腐烂经久不愈的病人(因为腐烂组织用人工方法很难清理干净)患处放入蛆,让蛆把腐烂组织吃光后再把蛆祛除.

吉安县17869483690： 吃腐肉,把蛆放在腐烂的伤口上,有没有治疗的可能 - ？
枕物斯诺： 有这种疗法,但不建议自己尝试,应该尽快去医院就诊,医院使用的蛆都是在无菌环境下培养的,自然环境下生长的蛆身上会携带一些细菌,不卫生.

吉安县17869483690： 屎蛆可以治病吗 - ？
枕物斯诺：目前,泰国数家医院正在试验一种“蛆疗法”,作为治疗糖尿病、伤口感染和溃疡的廉价、有效方法.这种特殊疗法的费用大约在250至375美元之间.具体方法是,首先把这种“药蛆”引入伤口处培育3天左右,让其破坏伤口内的坏死组织,同时清洁消毒伤口,而后促使人体伤口生成一种有助于新组织生成的生物酶.