如何利用SDS-PAGE判定蛋白质的纯度和分子量
要加BIS,ACR,TMEMD,APS还要保证充足的聚合时间,一般我都要过夜,12小时
(以下方法仅供参考)
溶液配制
1 Tricine凝胶buffer
称取SDS 0.3g,Tris 36.5g,用浓盐酸调pH至8.45,定容至100mL。4℃保存,1个月内使用。
2 5M HCL
浓盐酸稀释2.4倍,室温保存,1个月内使用。
3 49.5% Arc/Bis,3%C凝胶贮液
称取48g丙烯酰胺,1.5g甲叉双丙烯酰胺,蒸馏水溶解并定容至100mL。4℃保存,1个月内使用。
4 50%甘油
取50mL甘油,加蒸馏水至100mL。室温保存,1个月内使用。
5 10%过硫酸铵溶液
称取过硫酸铵10g,蒸馏水溶解并定容至100mL,分装成1.2mL/支。-20℃保存,一年内使用。
6 正极缓冲液
称取 Tris 24g,用800mL蒸馏水溶解,1M HCL调pH至8.9,定容至1L。4℃保存,一个月内使用。
7 负极缓冲液
称取Tris 12.1g,Tricine 17.9g,SDS 1g,加水溶解,定容至1L。2-8℃保存,半个月内使用。
8 非还原型样品缓冲液(2×)
量取100mM Tris-cl 1mL、溴酚兰20mg、十二烷基硫酸钠0.4g、甘油2mL,加蒸馏水溶解并稀释至10mL,冷冻保存,一年内使用。
9 考马斯亮兰染色液
称取考马斯亮兰R-250 0.25g,加入甲醇45mL、冰醋酸10mL、蒸馏水45mL,混匀即成,室温保存,1个月内使用。
10 脱色液
取甲醇450mL、冰醋酸100mL、注射用水450mL,混匀,室温保存,3个月内使用。
实验流程
1 凝胶模具的组装与检漏
取1.0mm厚度的长短玻璃板,清洗干净后组装模具。注:短板朝里,若只跑一块胶,电泳夹的对面也必须放置一块电泳板。模具组装完成后,沿长短玻璃板之间形成的空隙加入注射用水直至水加满,平放模具。30S后,若液面不下降,则倒掉模具中的水,侧立模具并用滤纸吸干长短玻璃板间的注射用水。若模具漏水,则重新组装模具。
2Tricine SDS-PAGE 凝胶配制
(1)配制下层胶:
16.5%分离胶 10mL
注射用水 0.68mL
Tricine 凝胶Buffer 3.4mL
49.5%Arc/Bis 3%C凝胶储液 3.4mL
50%甘油 2.72mL
TEMED 5μl
10%AP 100μl
(2)配制上层胶:
5%浓缩胶Buffer 6mL
注射用水 3.6mL
Tricine 凝胶Buffer 1.24mL
49.5%Arc/Bis 3%C凝胶储液 0.4mL
TEMED 6μl
10%AP 60μl
先配制下层胶,按下层胶配方依次加入相应溶液后,立即混匀(尤其是加入TEMED和10%AP时动作要快),倒入准备好的凝胶模具中,注意勿打入气泡,高度至槽高2/3-3/4。用移液器在凝胶上方轻轻加入蒸馏水,水封。20min凝胶聚合后,倒掉模具中水封用的蒸馏水,侧立模具,用滤纸吸干模具中的水,但不要接触到下层胶。再配制上层胶,向模具内倒入上层胶至满,插上1.0mm厚度的梳齿。20min凝胶聚合后,拆下模具托盘,将装置放于电泳槽中,向玻璃板之间加入负极液至漫过短板,在外侧尽量多地加入正极液,双手均匀用力拔出梳齿。注:负极液必须漫过短板,正极液加入时不要和负极液相通。
2 电泳
将样品与对照品用注射用水稀释至1mg/mL,取30uL与2×非还原型上样缓冲液30uL以1:1混合,煮沸2min,点样量20μl/孔(双复孔)。
分子量标准65℃预热5min,点样量10μl。恒流35mA,约2-3h结束。
3 染色和脱色
将电泳后的凝胶浸入装有染色液的容器中,于摇床上低速震荡染色约30min,然后更换为脱色液,于摇床上低速震荡脱色至背景全无。
数据处理
用Quantity one 分析软件分析电泳图片,计算出电泳纯度
SDS-PAGE判定蛋白质的分子量:
定义:R=de/do
R为迁移率,de为蛋白质电泳迁移距离,do为溴酚蓝电泳迁移距离
则lgM=a-bR
M为蛋白质分子量,a、b为常熟,a、b可由标准蛋白质(已知分子量的蛋白质)的迁移率算出。
若蛋白质为单肽链蛋白质,则M为其分子量;若蛋白质为多肽链蛋白质,则其分子量为各M之和
MHDD扫描硬盘~请问MHDD是什么东西
修复成功率(1类坏道百分之九十以上,2类坏道百分之八十,3类坏道百分之六十)此文章原创sdsq521,请勿转载!谢谢!以上方法对?号和W坏道的修复好象还不是太完美,现在我们利用MHDD的一些命令进行辅助和配合,IBM、富士通、西数这些可以查看硬盘缺陷的,最好先执行IBME、FUJLST等命令,然后执行一般模式扫描,扫描到W或者?这些...
如何修复一下硬盘? 最快的方法?
然后用MHDD的rhpa和nhpa恢复实际容量再进行扫描,完了再改为硬盘容量的一半,继续扫描,恢复容量扫描,最后把硬盘改为原始大小进行高级扫描一遍OK~!!!而且MHDD和很多修复软件可以配合使用,效果相当不错 你比如HDDREG,HDDL,HDDSPEED都可以很好的和MHDD配合用。还有更多的方法等待大家研究。 aerase命令:可以逐扇区进行清零...
如何解除mhdd的密码啊!
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为什么MHDD中要密码密码是什么?而且知道密码却不能用为什么…
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求硬盘smart复位方法
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谁知道MHDD硬盘修复工具的使用方法?我有中文版的,还是不大会用_百度...
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斋夏塞透: SDS-PAGE判定蛋白质的纯度:若该蛋白质是单肽链蛋白质,则电泳得到的只有一条蛋白带(两条色带:一条为溴酚蓝,一条为蛋白带);若得出多条电泳带,则应该用非SDS-PAGE进行电泳,得出单一蛋白带则为单一蛋白质 SDS-PAGE判定蛋白质的分子量: 定义:R=de/do R为迁移率,de为蛋白质电泳迁移距离,do为溴酚蓝电泳迁移距离 则lgM=a-bR M为蛋白质分子量,a、b为常熟,a、b可由标准蛋白质(已知分子量的蛋白质)的迁移率算出. 若蛋白质为单肽链蛋白质,则M为其分子量;若蛋白质为多肽链蛋白质,则其分子量为各M之和
楚州区17234616582: 怎么用电泳判定蛋白质是同源二聚体还是异源二聚体啊? - ?
斋夏塞透:[答案] 如果你的蛋白质可能的异源二聚体中两个亚基大小有差异(例如一个30kD,另一个50kD),那直接用SDS-PAGE就可以了.在SDS和DTT/beta-ME作用下二聚体中的两个亚基会完全分开,在泳道中按照分子量大小迁移,如能产生两个大小不同含量...
楚州区17234616582: SDS - PAGE测定蛋白质的基本原理是什么?简述它的主要步骤? - ?
斋夏塞透:[答案] 你必须先了解PAGE,它能有效地把不同类型的蛋白质分开的主要依据,是样品中各种物质的电荷和分子量的差异性.很长的原理.这里就当你了解了.SDS即十二烷基硫酸钠,是阴离子表面活性剂,它能以一定的比例和蛋白质结合,形成...
楚州区17234616582: SDS - PAGE测定蛋白质亚基分子量的原理是什么? - ?
斋夏塞透:[答案] 1) 蛋白质跑SDS-PAGE前要用蛋白处理液处理(沸水浴5分钟),其中含有SDS,beta-巯基乙醇使蛋白质四级结构破坏(如果有的话),呈游离亚基状态. 2)SDS-PAGE的原理就是仅仅根据蛋白质的分子量是蛋白质在电厂中移动,进而被分离. 3)再...
楚州区17234616582: 通过看蛋白质SDS - PAGE还原与非还原条件下的条带,怎样判断它们是单链蛋白还是双链? - ?
斋夏塞透:[答案] 蛋白之所以形成双体,是由于两个单体蛋白间通过二硫键的作用形成.跑还原电泳就是通过强还原剂把两个单体蛋白之间的二硫键打开,由此使两个蛋白分开. 判断单体还是双体的方法就是看条带的大小与多少.如果还原与非还原电泳跑出的条带都是同...
楚州区17234616582: 用SDS - PAGE电泳法测定蛋白质分子量是根据蛋白质分子所带的电荷量而定 - ?
斋夏塞透:[答案] 不是的~ SDS这种物质,可以掩盖掉蛋白质表面的所有电荷(抹平作用),所以,蛋白质在电场中的运动速度,才能够和他的分子量成唯一相关.所以SDS测蛋白质分子量 就是根据蛋白质在电场中迁移的距离来定的,和电荷量没有关系.
楚州区17234616582: SDS - PAGE测定蛋白质分子量的基本原理是什么?简述一下主要步骤 - ?
斋夏塞透:[答案] 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素.1967年Shapiro等人发现,如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS),大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合,即每...
楚州区17234616582: SDS - PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定的方法步骤是什? ?
斋夏塞透: 2.用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时,必须同时作标准曲线
楚州区17234616582: 怎么样检测蛋白质二聚体 - ?
斋夏塞透:[答案] 如果蛋白质是有二聚体的结构,那么表现出来的分子量应该是蛋白质理论分子量的两倍.SDS-PAGE因为有SDS和在上样缓冲液中加入2-ME的作用,会完全破坏二聚体的结构.虽然不能检测二聚体,但是可以检测出单体的分子量. 所以二聚体的检测需...
楚州区17234616582: sds - page电泳技术分离蛋白质是根据蛋白质什么性质不同 - ?
斋夏塞透:[答案] 蛋白质性质包括:稳定性(Stability),活性(Activity),分子量(MW),疏水性(Hydrophobicity),等电点(pI),二硫键(Disulfide linkage) SDS-PAGE时,因为SDS可以断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三...