如何利用SDS-PAGE判定蛋白质的纯度和分子量

SDS-PAGE测定蛋白质分子量实验，如何保证聚丙烯酰胺凝胶正常聚合···~

要加BIS，ACR，TMEMD,APS还要保证充足的聚合时间，一般我都要过夜，12小时

（以下方法仅供参考）
溶液配制
1 Tricine凝胶buffer
称取SDS 0.3g，Tris 36.5g，用浓盐酸调pH至8.45，定容至100mL。4℃保存，1个月内使用。
2 5M HCL
浓盐酸稀释2.4倍，室温保存，1个月内使用。
3 49.5% Arc/Bis，3%C凝胶贮液
称取48g丙烯酰胺，1.5g甲叉双丙烯酰胺，蒸馏水溶解并定容至100mL。4℃保存，1个月内使用。
4 50%甘油
取50mL甘油，加蒸馏水至100mL。室温保存，1个月内使用。
5 10％过硫酸铵溶液
称取过硫酸铵10g，蒸馏水溶解并定容至100mL，分装成1.2mL/支。-20℃保存，一年内使用。
6 正极缓冲液
称取 Tris 24g，用800mL蒸馏水溶解，1M HCL调pH至8.9，定容至1L。4℃保存，一个月内使用。
7 负极缓冲液
称取Tris 12.1g，Tricine 17.9g，SDS 1g，加水溶解，定容至1L。2-8℃保存，半个月内使用。
8 非还原型样品缓冲液（2×）
量取100mM Tris-cl 1mL、溴酚兰20mg、十二烷基硫酸钠0.4g、甘油2mL，加蒸馏水溶解并稀释至10mL，冷冻保存，一年内使用。
9 考马斯亮兰染色液
称取考马斯亮兰R-250 0.25g，加入甲醇45mL、冰醋酸10mL、蒸馏水45mL，混匀即成，室温保存，1个月内使用。
10 脱色液
取甲醇450mL、冰醋酸100mL、注射用水450mL，混匀，室温保存，3个月内使用。

实验流程
1 凝胶模具的组装与检漏
取1.0mm厚度的长短玻璃板，清洗干净后组装模具。注：短板朝里，若只跑一块胶，电泳夹的对面也必须放置一块电泳板。模具组装完成后，沿长短玻璃板之间形成的空隙加入注射用水直至水加满，平放模具。30S后，若液面不下降，则倒掉模具中的水，侧立模具并用滤纸吸干长短玻璃板间的注射用水。若模具漏水，则重新组装模具。
2Tricine SDS-PAGE 凝胶配制
（1）配制下层胶：
16.5%分离胶 10mL
注射用水 0.68mL
Tricine 凝胶Buffer 3.4mL
49.5%Arc/Bis 3%C凝胶储液 3.4mL
50%甘油 2.72mL
TEMED 5μl
10%AP 100μl
（2）配制上层胶：
5%浓缩胶Buffer 6mL
注射用水 3.6mL
Tricine 凝胶Buffer 1.24mL
49.5%Arc/Bis 3%C凝胶储液 0.4mL
TEMED 6μl
10%AP 60μl
先配制下层胶，按下层胶配方依次加入相应溶液后，立即混匀（尤其是加入TEMED和10%AP时动作要快），倒入准备好的凝胶模具中，注意勿打入气泡，高度至槽高2/3-3/4。用移液器在凝胶上方轻轻加入蒸馏水，水封。20min凝胶聚合后，倒掉模具中水封用的蒸馏水，侧立模具，用滤纸吸干模具中的水，但不要接触到下层胶。再配制上层胶，向模具内倒入上层胶至满，插上1.0mm厚度的梳齿。20min凝胶聚合后，拆下模具托盘，将装置放于电泳槽中，向玻璃板之间加入负极液至漫过短板，在外侧尽量多地加入正极液，双手均匀用力拔出梳齿。注：负极液必须漫过短板，正极液加入时不要和负极液相通。
2 电泳
将样品与对照品用注射用水稀释至1mg/mL，取30uL与2×非还原型上样缓冲液30uL以1：1混合，煮沸2min，点样量20μl/孔（双复孔）。
分子量标准65℃预热5min，点样量10μl。恒流35mA，约2-3h结束。
3 染色和脱色
将电泳后的凝胶浸入装有染色液的容器中，于摇床上低速震荡染色约30min，然后更换为脱色液，于摇床上低速震荡脱色至背景全无。

数据处理
用Quantity one 分析软件分析电泳图片，计算出电泳纯度

SDS-PAGE判定蛋白质的纯度:若该蛋白质是单肽链蛋白质，则电泳得到的只有一条蛋白带（两条色带：一条为溴酚蓝，一条为蛋白带）；若得出多条电泳带，则应该用非SDS－PAGE进行电泳，得出单一蛋白带则为单一蛋白质
SDS-PAGE判定蛋白质的分子量：
定义：R＝de/do
R为迁移率，de为蛋白质电泳迁移距离，do为溴酚蓝电泳迁移距离
则lgM=a-bR
M为蛋白质分子量，a、b为常熟，a、b可由标准蛋白质（已知分子量的蛋白质）的迁移率算出。
若蛋白质为单肽链蛋白质，则M为其分子量；若蛋白质为多肽链蛋白质，则其分子量为各M之和

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楚州区17234616582： 如何利用SDS - PAGE判定蛋白质的纯度和分子量？
斋夏塞透： SDS-PAGE判定蛋白质的纯度:若该蛋白质是单肽链蛋白质,则电泳得到的只有一条蛋白带(两条色带:一条为溴酚蓝,一条为蛋白带);若得出多条电泳带,则应该用非SDS-PAGE进行电泳,得出单一蛋白带则为单一蛋白质 SDS-PAGE判定蛋白质的分子量: 定义:R=de/do R为迁移率,de为蛋白质电泳迁移距离,do为溴酚蓝电泳迁移距离 则lgM=a-bR M为蛋白质分子量,a、b为常熟,a、b可由标准蛋白质(已知分子量的蛋白质)的迁移率算出. 若蛋白质为单肽链蛋白质,则M为其分子量;若蛋白质为多肽链蛋白质,则其分子量为各M之和

楚州区17234616582： 怎么用电泳判定蛋白质是同源二聚体还是异源二聚体啊? - ？
斋夏塞透：[答案] 如果你的蛋白质可能的异源二聚体中两个亚基大小有差异(例如一个30kD,另一个50kD),那直接用SDS-PAGE就可以了.在SDS和DTT/beta-ME作用下二聚体中的两个亚基会完全分开,在泳道中按照分子量大小迁移,如能产生两个大小不同含量...

楚州区17234616582： SDS - PAGE测定蛋白质的基本原理是什么?简述它的主要步骤? - ？
斋夏塞透：[答案] 你必须先了解PAGE,它能有效地把不同类型的蛋白质分开的主要依据,是样品中各种物质的电荷和分子量的差异性.很长的原理.这里就当你了解了.SDS即十二烷基硫酸钠,是阴离子表面活性剂,它能以一定的比例和蛋白质结合,形成...

楚州区17234616582： SDS - PAGE测定蛋白质亚基分子量的原理是什么? - ？
斋夏塞透：[答案] 1) 蛋白质跑SDS-PAGE前要用蛋白处理液处理(沸水浴5分钟),其中含有SDS,beta-巯基乙醇使蛋白质四级结构破坏(如果有的话),呈游离亚基状态. 2)SDS-PAGE的原理就是仅仅根据蛋白质的分子量是蛋白质在电厂中移动,进而被分离. 3)再...

楚州区17234616582： 通过看蛋白质SDS - PAGE还原与非还原条件下的条带,怎样判断它们是单链蛋白还是双链? - ？
斋夏塞透：[答案] 蛋白之所以形成双体,是由于两个单体蛋白间通过二硫键的作用形成.跑还原电泳就是通过强还原剂把两个单体蛋白之间的二硫键打开,由此使两个蛋白分开. 判断单体还是双体的方法就是看条带的大小与多少.如果还原与非还原电泳跑出的条带都是同...

楚州区17234616582： 用SDS - PAGE电泳法测定蛋白质分子量是根据蛋白质分子所带的电荷量而定 - ？
斋夏塞透：[答案] 不是的~ SDS这种物质,可以掩盖掉蛋白质表面的所有电荷(抹平作用),所以,蛋白质在电场中的运动速度,才能够和他的分子量成唯一相关.所以SDS测蛋白质分子量 就是根据蛋白质在电场中迁移的距离来定的,和电荷量没有关系.

楚州区17234616582： SDS - PAGE测定蛋白质分子量的基本原理是什么?简述一下主要步骤 - ？
斋夏塞透：[答案] 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素.1967年Shapiro等人发现,如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS),大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合,即每...

楚州区17234616582： SDS - PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定的方法步骤是什? ？
斋夏塞透： 2.用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时,必须同时作标准曲线

楚州区17234616582： 怎么样检测蛋白质二聚体 - ？
斋夏塞透：[答案] 如果蛋白质是有二聚体的结构,那么表现出来的分子量应该是蛋白质理论分子量的两倍.SDS-PAGE因为有SDS和在上样缓冲液中加入2-ME的作用,会完全破坏二聚体的结构.虽然不能检测二聚体,但是可以检测出单体的分子量. 所以二聚体的检测需...

楚州区17234616582： sds - page电泳技术分离蛋白质是根据蛋白质什么性质不同 - ？
斋夏塞透：[答案] 蛋白质性质包括:稳定性(Stability),活性(Activity),分子量(MW),疏水性(Hydrophobicity),等电点(pI),二硫键(Disulfide linkage) SDS-PAGE时,因为SDS可以断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三...