如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆人的P53基因？并作最终鉴定。
大肠杆菌 质粒 mrna水平有没有变化
杆菌耐药性的影响,采用实时荧光定量方法检测了外输泵acrA mRNA表达水平的变化。...培养大肠杆菌,做药敏试验,同时提取质粒,检测大肠杆菌外输泵基因acrA的mRNA表达量
目前通用的分类方法将干扰素分为三型：
Ⅰ型：有IFN-α和IFN-β，其中IFN-α有二十余个亚型，IFN-β仅有一个亚型。Ⅰ型干扰素具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性、参与免疫调节、抗肿瘤等作用。
Ⅱ型：只有IFN-γ，且只有一种亚型，除具有抗病毒、抗增殖活性外，其主要生物学活性为免疫调节作用。
Ⅲ型：即IFN-λ1（IL-29）、IFN-λ2（IL-28a）和IFN-λ（IL-28b）。
IFN-ω属于IFN-α家族，其结构和大小与其它IFN-α稍有差异，但抗原性有较大的不同。
自80年代以来，许多研究显示，干扰素（尤其是α-干扰素及γ-干扰素）除具有抗病毒、免疫调节的作用外，还具有明显的抗细胞增殖作用。因此，目前干扰素已被用于治疗多种白血病。
方法2:自己构建时，主要将你从人源细胞系中抽提总mRNA,然后反转录。
将反转录的总cDNA作为模板，通过PCR 特异的P53引物，克隆出这个基因
然后凝胶电泳分离纯化PCR产物；然后将该PCR产物插入到带有抗性的大肠杆菌质粒中。
涂板后，筛选阳性克隆数个，再用酶切作鉴定，找到合适的质粒；
最后再将该质粒进行测序。确定该质粒无突变。
就是利用基因工程
首先提取目的基因 从细胞的信使RNA中提取出P53基因
构建基因表达载体 将目的基因P53和载体-大肠杆菌质粒重组
将目的基因导入受体细胞 可以选择大肠杆菌或动植物细胞作为受体细胞，导入重组DNA
检测和鉴定 可采用发射性同位素标记法检测P53
首先是活的cDNA：
提取细胞总RNA→设计引物，反转录PCR得到P53的cDNA→凝胶电泳并回收目的片段→纯化→将纯化后的片段与T载体连接(16℃ 过夜)→转化JM109感受态细胞→涂布氨苄抗性平板→37℃ 过夜培养→挑取转化子→菌落PCR验证→电泳分析得到阳性转化子→将阳性转化子接种LB培养基37℃培养过夜→收集菌体→提取质粒→得到P53基因的克隆载体。
mRNA很容易分解的~~~很难提取
如果你能提取到,首先逆转录PCR合成cDNA
将cDNA转入质粒中(用限制性内切酶酶切)
再将重组质粒导入大肠杆菌
1、如何以大肠杆菌的质粒DNA为载体克隆一个编码动物的技术的基并使之...
最大的问题应该是：大肠杆菌是原核生物，动物基因是真核基因，直接用限制酶切获得的基因在大肠杆菌内表达会错误，应该选择动物的相应基因的mRNA反转录得到DNA，或者根据相应蛋白质的氨基酸排列顺序推测DNA的碱基序列获得DNA。其余的如楼上后面所答。
在基因克隆中为什么要使用失去了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒...
因为有许多限制性内切酶是甲基化敏感的，可能无法完全甚至完全不能切开甲基化后的质粒DNA。
高中与大肠杆菌有关的知识点有哪些
千万不要把大肠杆菌细胞内的质粒当成细胞器，质粒是小型环状DNA分子；代谢方面：大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型，常生活于动物和人的肠道内，但和人与动物的关系是互利共生关系；基因工程和发酵工程方面：可以利用大肠杆菌的质粒将人和动物的某些基因转导入其体内，...
为什么受体细胞是大肠杆菌时选用质粒和噬菌体作载体? 动物病毒与植物病 ...
质粒是环状DNA分子，噬菌体遗传物质也是DNA，目的基因也是DNA组成，故用以作为重组分子，进行运输导入受体细胞；病毒相对于上述两种变异性较大，且遗传物质多为RNA
使用DNA分子杂交法检测大肠杆菌是否导入质粒的理由是什么
就是说你外源 基因 导入了 质粒 中，那么你用与导入的外源基因互补的DNA 分子 单链去和质粒做杂交，如果能够形成 双链 ，那么就是说你的外源基因成功的导入了质粒中。
为什么最常用的运载体是大肠杆菌的质粒呢?
因为大肠杆菌的遗传背景清楚、各项优势明显。 像最常用的大肠杆菌质粒是pBR322质粒，因为其复制是松弛型（质粒能大量的复制），具有四环素和氨青霉素抗性基因标记（便于筛选），并具有一些便于应用的限制性核酸内切酶位点。
从大肠杆菌中分离得到的质粒DNA是否有线性分子存在?
理论上说大肠杆菌中的质粒均为环状双链DNA分子，但不排除物理的损伤使环状分子断裂成为线状。若提取分离过程中质粒DNA有所污染（被基因组DNA所污染），也会有线状DNA的存在。其实，要证明有没有线状DNA分子跑个胶就一目了然了。
为什么受体细胞是大肠杆菌时选用质粒和噬菌体作载体
载体的主要用途是将目的基因带入受体细胞且对受体细胞的生存不会产生太大影响。大肠杆菌里本来就有质粒，换句话说，质粒可以从大肠杆菌里提取出来；而用噬菌体的宿主细胞就是大肠杆菌。所以受体细胞是大肠杆菌时通常选用质粒和噬菌体作载体。
用什么方法可以得到大肠杆菌的质粒?
p1：葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA是Ca²⁺和Mg²⁺等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性；可添加RNase A消化RNA。p2：此步为碱处理。其中NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜...
大肠杆菌为甚么可以作为受体细胞,大肠杆菌里没内质网与高尔基体,为什么...
大肠杆菌可以作为受体细胞，是因为它拥有游离于拟核之外的可表达环状DNA——质粒。所以引入DNA片段要相对容易一些。而且大肠杆菌繁殖快，易培养，比较适宜工业生产。大肠杆菌有核糖体，就足以表达它的DNA了。蛋白质的合成，不是必须经过内质网和高尔基体的。大量生产的原因，是因为菌量大、代谢快、增值快 ...
席虹安素：[答案] 利用PCR扩增基因,经测序正确后,酶切连接到质粒,转化大肠杆菌筛选阳性克隆,鉴定正确后诱导表达,通常是用IPTG诱导
海南区15566344370： 1、如何以大肠杆菌的质粒DNA为载体克隆一个编码动物的技术的基并使之在大肠杆菌中表达 - ？
席虹安素： 最大的问题应该是:大肠杆菌是原核生物,动物基因是真核基因,直接用限制酶切获得的基因在大肠杆菌内表达会错误,应该选择动物的相应基因的mRNA反转录得到DNA,或者根据相应蛋白质的氨基酸排列顺序推测DNA的碱基序列获得DNA. 其余的如楼上后面所答.
海南区15566344370： 如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码蛋白的基因,并使之在大肠杆菌中表达 - ？
席虹安素： 一般程序如下: 获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中 (测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、 纯化、进一步检测. [主要试剂 主要试剂] 主要试剂 1、LB 培养基. 2、 100mM IPTG (异丙基硫...
海南区15566344370： 如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆人的P53基因?并作最终鉴定. - ？
席虹安素： 就是利用基因工程 首先提取目的基因 从细胞的信使RNA中提取出P53基因 构建基因表达载体 将目的基因P53和载体-大肠杆菌质粒重组 将目的基因导入受体细胞 可以选择大肠杆菌或动植物细胞作为受体细胞,导入重组DNA 检测和鉴定 可采用发射性同位素标记法检测P53
海南区15566344370： 如何利用大肠杆菌做寄主进行DNA克隆并使外源基因得到表达 - ？
席虹安素： 鉴于原核基因表达和真核基因表达之间的差异,克隆的真核基因在大肠杆菌表达系统中正确表达的最基本条件是,能够进行正常的转录和转译,转译后加工、新生多肽在细胞中的稳定性及分布.克隆的外源基因的正确转录,需要置于能够被宿主...
海南区15566344370： 有关生物化学的问题.如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因....？
席虹安素： 用大肠杆菌表达载体就行啊!问题就是,ORF要正确,表达的蛋白可能被降解,激素基因要把内含子去掉,启动子、终止子都要用大肠杆菌的等等.
海南区15566344370： 如何将野生型细菌质粒改造成基因克隆载体 - ？
席虹安素： 首先要做的就是鉴定质粒的最小复制子. 得到最小复制子后将多克隆位点、选择标记基因即可. 如果要构建穿梭载体,则需要加上大肠杆菌复制子.或者,直接在大肠杆菌克隆载体非多克隆位点上插入鉴定的最小复制子. 如果要构建表达载体,则需要在单克隆位点上下游分别加上高效启动子和终止子.
海南区15566344370： 简述基因克隆的基本步骤 - ？
席虹安素： 1. 扩增目的基因,比如通过PCR的方法. 2. PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒. 3. 转染大肠杆菌 4. 筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法,就是在载体上,序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列,如果不被破坏,产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物,形成蓝色产物.如果有目的序列插入,这个酶就不能表达,形成的克隆就是白色的.5. 挑取阳性克隆,测序确认无变异和方向后,扩增质粒,提纯质粒.
海南区15566344370： 克隆未知基因的方法有哪些? - ？
席虹安素： 克隆方案(以拟南芥为例)(1)建立拟南芥诱变群体.采用拟南芥的化学诱变方法进行诱变处理:将约250mg野生型拟南芥种子用乙基甲磺酸(EMS)处理,得到M2代种子,供突变体筛选使用.该方法的优点是诱变率较高,操作过程比较简单...
海南区15566344370： 怎样从菌体中克隆目标基因? 怎样把克隆的基因转到质粒上? - ？
席虹安素： 1克隆的话只要给予充足的原料和环境,然后刺激进行复制 2用相同的剪切酶在基因和质粒上剪下,因为酶一样,,所以可以把剪下的目标基因接到质粒上,当然需要连接酶的帮助
