SnapGene简单入手（二）
作者&投稿：郁思 （若有异议请与网页底部的电邮联系）
这部分以pEGF-N1为backbone，human p53 coding sequence 为插入序列，用传统的双酶(EcoR I和BamH I)切重组质粒的方法，介绍质粒元件和snapgene的基本操作流程。
1. Snapgene 打开pEGF-N1
SnapGene打开新文件的方式有两种，一种是找到质粒的全部序列，复制粘贴或者直接将质粒序列TXT文档拖拽到snapgene，snapgene会自动识别，即可打开质粒图谱；另外一种是输入，NCBI序列，addgene序列，snapgene在线序列，输入想要查找的质粒名称/编号，即可在线加载出来质粒。全面的是打开snapgene弹出的界面，后面的是通过工具栏打开新文件。
收藏的工具是将多个质粒全部放在一个收藏夹中，相当于照片放在相册里，打开一个收藏夹就是你自己保存的质粒组，方便进行质粒的管理，但是这个功能sanpgene viewer没有。
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2. pEGF-N1
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大部分元件如复制起点，抗性基因，蛋白标签等在前面已经介绍过了，还有模糊的可以翻回去看看，这里补充一下终止子。
终止子：顾名思义就是终止mRNA转录的因子，界定了一个转录单元的结束，位于基因下游，通常紧跟着polyA(聚腺苷酸：多个腺苷酸(A)，在真核中ployA能延长转录本的寿命，保持稳定；原核生物中加快转录本的讲解)。
原核的转录子分为两类：一类是依赖 ρ因子(Rho)，一类是不依赖的。ρ因子是一种解旋酶，能够辅助RNA聚合酶转录终止，此系统在质粒中比较少见；在细胞表达质粒中常见的是非ρ因子依赖的终止子。非依赖性ρ因子是一种固有强终止子，即富含GC的回文结构，富含氢键。下图为非典型ρ因子终止子示意图。几乎所有常用细胞表达质粒都是非ρ因子终止子，包括T7，rrnB等。
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真核的转录在启动子的时候讲过按照核酶分为三类，核酶I，II，和III。每种核酶终止方式不同，核酶I用来转录rRNA，依赖ρ因子类似原核；核酶II转录mRNA和miRNA，依赖ρ因子和RNA酶相关蛋白参与招募剪切和加polyA；聚合酶III转录tRNA和smRNA，依赖特定RNA二级结构和特定序列。
哺乳动物细胞表达质粒常用于转录mRNA，常用终止子有SV40，hGH，BGH和rbGlob等，polyA信号序列同终止序列是同意的。
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如上图所示，在polyA与富含GU之间协同进行切割，释放mRNA和核酶，polyA尾在mRNA核外转运和翻译过程中起维持mRNA稳定、避免其被降解的重要作用。但是在病毒载体中，polyA与包装系统连用，会降低病毒滴度，延长转录本的寿命，所以使用较弱的终止信号。
3. Human p53 设计引物
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在NCBI中搜索human p53，找到相对应的mRNA序列，搜索找到CDS区域，如图中深色部分，然后复制粘贴到snapgene中，用来构建引物。
将human p53的CDS 按照前面添加DNA文件的方法，在snapgene中打开，选择BamHI酶和EcoRI酶进行酶切，引物设计需要添加酶切位点和保护碱基。
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按照自己需要，命名完整准确，酶切问点可以在snapgene中选择添加，保护碱基可以百度查看。
使用snapgene模拟功能，能够看到PCR反应产物，有两个酶切位点存在，将扩增产物保存好。
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4. 克隆
在snapgene中有模拟克隆的功能，能够将双酶切克隆的结果可视化，让自己做到心中有数。行动--限制和插入片段克隆--插入片段。
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选择好各自的酶切位点，即可看到自己设计的质粒。这部分主要以双酶切重组质粒为基础，快速熟悉snapgene的简单引物设计，PCR反应，插入片段克隆以及补充的终止子等，希望能有所帮助。
包言孚茵： 只需要在左边的显示酶切位点的小三角处点一下,选择“unique cutters”或者自己想要的选项就可以.
秀峰区18797288616： 求GeneTool - ？
包言孚茵： 以我的感受,GeneTool不如另一款软件snapGene好用,而且snapGene功能更强大,操作更简洁,你要的话留邮箱吧
秀峰区18797288616： snapgene可以设计引物吗 - ？
包言孚茵： 35s启动子,是花椰菜病毒的启动子,是一种强启动子,被广泛应用于转基因植物中,对它进行改造的许多启动子可以有效提高外源基因的表达水平.同时对该启动子的一些元件进行串联,也可以有效提高外源基因的表达水平.
秀峰区18797288616： 大专网络专业,工作两年电力行业,学SAP哪个模块好? - ？
包言孚茵： 1.你好,学习sap是一项大工程,本身就有12个模块,一个模块要熟练的话都要个四五年以上.如果是学的话最好是从bw模块开始学,很容易入手.你学过编程,有这样的逻辑对学习bw这个模块蛮有利的. 2.bw模块很容易成为项目经理的,你...
秀峰区18797288616： 萧和笛那个更容易上手?推荐一款适合新手的.第一问要说原因,第二问要报参数 - ？
包言孚茵： 笛子吧,箫这种乐器对乐感的要求更好一些,气息的把握也难,相比之下,笛子简单点,就是笛子对笛膜的要求高,初学可以用透明胶布应付一下,常用的笛子D、E调,比较容易上手,但是有一点,乐器本身构造越简单的,学起来越难,看看小提和二胡就知道了,希望可以帮到你
秀峰区18797288616： 丝路传说2容易上手吗?好玩吗? - ？
包言孚茵： 游戏的战斗上手还是比较简单的,为站桩式打法.技能效果比较华丽,不过打击感就很一般了,技能打在怪物身上都没什么反馈效果.推荐你玩一下斗仙,斗仙是3D即时制rpg游戏,不是回合制的.这个游戏是主打战斗、pk、画面.这游戏最吸引我的地方就是打击感特别好,可以把人把怪打飞,各种动作震屏,反正就是战斗的时候从头到尾都会让人很兴奋.
秀峰区18797288616： 挑选一台好的燃气灶,要从哪些方便着手呢? - ？
包言孚茵： 下面的内容会给大家讲解怎样选购燃气灶技巧和注意事项以便于帮助大家正确的选购燃气灶! 一、怎样选购燃气灶? 1、首先要清楚自己家里所使用的气种,也就是选烧的(管道气T)、烧液化石油气(瓶装气Y)、还是烧人工煤气(管道气R)...
秀峰区18797288616： 为什么我吹口哨只有一个音,怎么样才能吹出来歌啊?? - ？
包言孚茵： 你好,这是我的回答:练习口哨从哪里入手1、第一步:要练习发声.开始练习时吹不出声音,只吹出气流的声音很正常.这时,你不要及急噪,慢满来.口哨的基本要素有“三要素”:一是口唇(双唇)、二是气流(包括从人体内存的气体...
