细胞计数板如何使用

血细胞计数板怎样使用~

血球计数板 　　1 血球计数板
．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释100倍），以每小格的菌数可数为度。 2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 　　3．将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上（不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。 　　4．静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。 　　5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的 　　血球计数板 　　 血球计数板
菌数（即80个小格）。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。见右图：即本格中计数细胞为3个。6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2-3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），按公式计算出每mL（g）菌悬液所含细胞数量。 　　7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
以计数酵母菌为例 　　(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数. 　　(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可. 　　(3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的厚玻片. 　　(4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内. 　　(5)计数时,如果使用16格×25格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数.如果规格为25格×16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数. 　　(6)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞). 　　(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数. 　　3.计算公式 　　(1)16格×25格的血球计数板计算公式: 　　酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100×400×10四次方×稀释倍数 　　(2)25格x16格的血球计数板计算公式: 　　酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80×400×10四次方×稀释倍数 　　4.血球计数板的清洁 　　血球汁数板使用后,用自来水冲洗,切勿用硬物洗刷,洗后自行晾干或用吹风机吹干,或用95%的乙醇,无水乙醇,丙酮等有机溶剂脱水使其干燥.通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物.若不干净,则必须重复清洗直到干净为止.

血球计数板 　　
1. 视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释100倍），以每小格的菌数可数为度。 2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 　　
3．将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上（不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。 　　4．静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。 　　
5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的菌数（即80个小格）。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。见右图：即本格中计数细胞为3个。
6．每个样品重复计数2-3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），按公式计算出每mL（g）菌悬液所含细胞数量。 　　
7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方 格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它 们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。
使用细胞计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
细胞计数板-使用方法
1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释100倍），以每小格的菌数可数为度。
2．取洁净的细胞计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3．将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数 区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上（不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成 计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。
4．静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将细胞计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的菌数（即80个小格）。为 了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数 左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。见下图：即本格中计数细胞为3个。

（细胞压线，仅计数相邻的两条线上的细胞）
6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2-3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），按公式计算出每mL（g）菌悬液所含细胞数量。
7．测数完毕，取下盖玻片，用水将细胞计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
细胞计数板-计数公式
1、16格×25格的细胞计数板计算公式：
细胞数/ml=100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数
1、25格×16格的细胞计数板计算公式：
细胞数/ml=80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数
网摘：http://blog.tianya.cn/blogger/post_read.asp?BlogID=1766764&PostID=17108229
之前写的细胞计数板使用，其中的图片天涯都给删了，我没有备份。今天浏览网页看到一个英文版的介绍，写的很好。
Using a Counting Chamber
For microbiology, cell culture, and many applications that require use of suspensions of cells it is necessary to determine cell concentration. One can often determine cell density of a suspension spectrophotometrically, however that form of determination does not allow an assessment of cell viability, nor can one distinguish cell types.
A device used for determining the number of cells per unit volume of a suspension is called a counting chamber. The most widely used type of chamber is called a hemocytometer, since it was originally designed for performing blood cell counts.

To prepare the counting chamber the mirror-like polished surface is carefully cleaned with lens paper. The coverslip is also cleaned. Coverslips for counting chambers are specially made and are thicker than those for conventional microscopy, since they must be heavy enough to overcome the surface tension of a drop of liquid. The coverslip is placed over the counting surface prior to putting on the cell suspension. The suspension is introduced into one of the V-shaped wells with a pasteur or other type of pipet. The area under the coverslip fills by capillary action. Enough liquid should be introduced so that the mirrored surface is just covered. The charged counting chamber is then placed on the microscope stage and the counting grid is brought into focus at low power.　

It is essential to be extremely careful with higher power objectives, since the counting chamber is much thicker than a conventional slide. The chamber or an objective lens may be damaged if the user is not not careful. One entire grid on standard hemacytometers with Neubauer rulings can be seen at 40x (4x objective). The main divisions separate the grid into 9 large squares (like a tic-tac-toe grid). Each square has a surface area of one square mm, and the depth of the chamber is 0.1 mm. Thus the entire counting grid lies under a volume of 0.9 mm-cubed
Suspensions should be dilute enough so that the cells or other particles do not overlap each other on the grid, and should be uniformly distributed. To perform the count, determine the magnification needed to recognize the desired cell type. Now systematically count the cells in selected squares so that the total count is 100 cells or so (number of cells needed for a statistically significant count). For large cells this may mean counting the four large corner squares and the middle one. For a dense suspension of small cells you may wish to count the cells in the four 1/25 sq. mm corners plus the middle square in the central square. Always decide on a specific counting patter to avoid bias. For cells that overlap a ruling, count a cell as "in" if it overlaps the top or right ruling, and "out" if it overlaps the bottom or left ruling.
Here is a way to determine a particle count using a Neubauer hemocytometer. Suppose that you conduct a count as described above, and count 187 particles in the five small squares described. Each square has an area of 1/25 mm-squared (that is, 0.04 mm-squared) and depth of 0.1 mm. The total volume in each square is (0.04)x(0.1) = 0.004 mm-cubed. You have five squares with combined volume of 5x(0.004) = 0.02 mm-cubed. Thus you counted 187 particles in a volume of 0.02 mm-cubed, giving you 187/(0.02) = 9350 particles per mm-cubed. There are 1000 cubic millimeters in one cubic centimeter (same as a milliliter), so your particle count is 9,350,000 per ml. 　
Cells are often large enough to require counting over a larger surface area. For example, you might count the total number of cells in the four large corner squares plus the middle combined. Each square has surface area of 1 mm-squared and a depth of 0.1 mm, giving it a volume of 0.1 mm-cubed. Suppose that you counted 125 cells (total) in the five squares. You then have 125 cells per 0.5 mm-cubed, which is 250 cells/mm-cubed. Again, multiply by 1000 to determine cell count per ml (250,000).　

在细胞培养工作中，常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度，如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别，冻存细胞复苏后的活力检测等。细胞悬液制备后，常用活体染料台盼蓝对细胞进行染色，进行细胞计数。台盼蓝不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色。而死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞内而使细胞着色（蓝色）。细胞计数一般用血细胞计数板，按白细胞计数方法进行计数，便于确定细胞的生活状况。

所需物品

Ø 0.4％台盼蓝溶液

Ø 无水乙醇或95％乙醇溶液

Ø 脱脂棉

Ø 相差显微镜

Ø 试管、吸管、毛细吸管

Ø 细胞计数板

细胞计数方法

1. 将动物细胞用PBS制备成适当浓度的细胞悬液备用。

2. 用无水乙醇或95％乙醇溶液擦拭计数板后，用绸布擦净，另擦净盖玻片一张，把盖片覆在计数板上面。

3. 用滴管吸取0.4％台盼蓝染液，按1∶1比例加入细胞悬液中。从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖片之间的空隙中。注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡，否则要重做。稍候片刻，将计数板放在低倍镜下（10×10倍）观察计数。

4. 按图计算计数板的四角大方格（每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方格中，如果有细胞位于线上，一般计下线细胞不计上线细胞，计左线细胞不计右线细胞。二次重复计数误差不应超过±5％。镜下观察，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞。

5. 计完数后，需换算出每ml悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为0.01cm2，高为0.01cm，这样它的体积为0.0001 cm3，即0.1 mm3。由于1ml＝1000 mm3，所以每一大方格内细胞数×10,000＝细胞数/ml，故可按下式计算：

细胞悬液细胞数/ml＝4个大格细胞总数/4×10,000

6. 如计数前已稀释，可再乘稀释倍数。

7. 计数细胞后，计算细胞悬液浓度并求出存活与死亡细胞数的比例。

注意事项

1. 向计数板中滴细胞悬液时要干净利落，加量要适当，过多易使盖片漂移，或淹过盖片则失败，需重做；过少易出现气泡；不理想时，应重做；

2. 镜下计数时，若方格中细胞分布明显不均，说明细胞悬液混合不均匀，需重新将细胞悬液进行混合，再重新计数。

3. 计数时，对于位于边线或交界处的细胞/细胞团，遵循“计上不计下，计左不计右”的规则；

4. 一个细胞团计做一个细胞

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榆中县17359526088： 血细胞计数板怎样使用？
暴恒曲克： 洗净后,将盖玻片盖在计数板上,用移液管吸取样品,轻轻滴在盖玻片与计数板载玻片的边缘上,利用虹吸现象就好.记住要先将盖玻片盖好,再利用虹吸现象,而不是一般玻璃制片时先滴加样品再盖盖玻片.然后静置,就可以在低倍镜下观察了.

榆中县17359526088： 如何使用血球计数板. - ？
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榆中县17359526088： 下列关于血细胞计数板结构和使用方法的叙述,正确的是() - ？
暴恒曲克：[选项] A. 一块血细胞计数板的中央平台上有一个计数室 B. 血细胞计数板使用结束后,用清水冲洗、晾干 C. 利用血细胞计数板计数微生物时,需尽量减少微生物的结团现象 D. 利用血细胞计数板计数微生物时,需先盖上盖玻片再滴加样液

榆中县17359526088： 使用血细胞计数板对酵母菌计数时为什么要先放置盖玻片,再加培养液,使培养液自行深入? - ？
暴恒曲克： 一般的血细胞计数板 双凹槽 使用时先盖上盖玻片 后用滴管从边上轻加液体 这么做会减少气泡 不用担心液体不进去 表面张力会使液体进入 如果直接加液可能会产生气泡 会污染周边 等一系列问题

榆中县17359526088： 高中常用的细胞计数法有哪几种?分别适用于哪种情况? - ？
暴恒曲克：[答案] 细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法.一般利用计数板(血球计数板)进行.即可用于分离(散)细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,也可用于对培养物的细胞数量进行计数.不论计数的对象如何,均须制备分散的细...

榆中县17359526088： 血球计数板使用方法 - ？
暴恒曲克： http://liushuai3000.blog.hexun.com/8593453_d.html

榆中县17359526088： 用细胞计数板怎么控制细胞计数在一定范围呢 - ？
暴恒曲克： 计数板本来就是用于计数细胞的,并不是用于控制细胞数量的.如果你希望让液体中的细胞含量在某个范围,可以通过计数板计数细胞含量,然后根据计算出的细胞量大致算一下需要稀释多少,然后加生理盐水或实验需要的溶液进行稀释就可以了.当然因为计数板计数结果存在比较大的不确定性,最好逐渐尝试稀释.

榆中县17359526088： 细胞计数板对酵母菌计数时为什么要先 - ？
暴恒曲克： 这与血球计数板的结构有关,将菌悬液摇匀,用滴管吸取少许,从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴(不宜过多),让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区,勿使气泡产生,并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液.也可以将菌悬液直接滴加在计数区上(不要使计数区两边平台沾上菌悬液,以免加盖盖玻片后,造成计数区深度的升高),然后加盖盖玻片(勿使产生气泡). 4.静置片刻,使细胞沉降到计数板上,不再随液体漂移.将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳,先在低倍镜下找到计数区后,再转换高倍镜观察并计数.由于生活细胞的折光率和水的折光率相近,观察时应减弱光照的强度.

榆中县17359526088： 用细胞计数板进行细胞计数时如何区分细胞和杂质??还有为了在显微镜下找到计数室,该如何调节显微镜? - ？
暴恒曲克： 1.避免技术误差,纠正仪器误差(1)所用器材均应清洁干燥,计数板、血盖片②在高倍镜下计数时,避开有核细胞.有核细胞体积比正常红细胞大,中央无

榆中县17359526088： 血球计数板的构造使用 - ？
暴恒曲克： 血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的.玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台.中间的平台较宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面,刻有一个方格网.方格网上刻有9个大方格,其中只有中间的一个大方格为计数室,供微生物计数用.这一大方格的长和宽各为1mm,深度为0.1mm,其体积为0.1mm3.计数室通常有两种规格.一种是大方格内分为16中格,每一中格又分为25小格;另一种是大方格内分为25中格,每一中格又分为16小格.但是不管计数室是哪一种构造;它们都有一个共同的特点,即每一大方格都是由16*25=25*16=400个小方格组成,见图.