影响木霉蛋白分泌途径效率的生理和突变调控

木霉的蛋白质分泌途径~

蛋白质的多肽链在细胞质中合成并在内质网膜易位进入分泌途径。在真核生物中有两种类型的蛋白易位过程，即共翻译转运和翻译后转运，前者在哺乳动物细胞中比较常见，而这两种类型共存于酿酒酵母中；丝状真菌中新生多肽的易位主要采用共翻译转运方式。
多肽进入内质网后，在一系列折叠酶和伴侣蛋白协助下进行蛋白的正确折叠并装配成寡聚体，同时新合成的多肽被糖基化，核心N-聚糖结合于内质网膜上寡糖转移酶复合体的一个Asn残基上。蛋白质在内质网与高尔基体之间的运输是由转运包被小泡介导的。有COPⅠ和COPⅡ两种类型包被小泡。COPⅡ包被小泡将初步成熟的蛋白质从内质网运输到高尔基体，在COPⅠ包被小泡的帮助下蛋白质穿过高尔基体被运送到反面，同时错误折叠的蛋白也会通过COPⅡ小泡被重新运回内质网进行重新折叠。T.reesei的基因sarT，是编码参与蛋白质从内质网到高尔基体运输过程的蛋白质之一，编码的蛋白质较小，是一种GTP-结合蛋白。来自木霉的该基因编码序列，与酵母sar1基因有72%的同源性，而与曲霉SAR1蛋白有86%的相似性，说明木霉中存在分泌型小泡（Punt et al.，1996；Saloheimo et al.，1996；Kurzatkowski et al.，1996）。
初步成熟的蛋白质转运到高尔基体后，继续进行翻译后修饰，例如N-连接的糖基化修饰，O-连接的糖基化修饰和磷酸化等过程。通过超微结构研究，发现在木霉中存在高尔基体（Ghosh et al.，1990；Kurzatkowski et al.，1996），通过生物化学手段，在其他生物中展示了典型的高尔基体相关酶活性，例如Kex2 蛋白酶（Goller et al.，1997），O-甘露糖基化最后一步反应的发生（Kruszewska et al.，1989），真菌分泌型蛋白中前体氨基酸序列中的Kex2型蛋白质裂解目标物，这些都确认在木霉中存在高尔基体。在T.reesei中，分泌型蛋白的Kex2-型裂解很重要，如果抑制Kex2 p活性，将导致分泌蛋白的减少，并且非裂解的蛋白在胞内同时发生积累现象（Goller et al.，1997）。最后，通过高尔基体腔体以后，分泌小泡将蛋白质运送到不同的目标位置，例如液泡、细胞质膜、内吞体等细胞器，在木霉菌丝生长的顶端，小泡与细胞质膜融合，将分泌蛋白释放到周质空间（Valkonen et al.，2003）。
过量表达的外源蛋白超出细胞的承受能力，多肽链不能及时正确折叠，从而在内质网内形成错误折叠或未折叠的蛋白质积累，会严重影响蛋白的转运和分泌，这是造成外源蛋白产量低的一个重要因素。在表达系统中，转移到内质网的大流量蛋白对蛋白折叠、转运及合成蛋白的质量控制提出了更高要求。
蛋白通过细胞内膜系统的蛋白分泌途径被分泌到细胞表面，分泌蛋白随同细胞内其他位置比如质膜、液泡或高尔基复合体的蛋白一起通过内膜系统转运（Conesa et al.，2001；Spang，2008；Shoji et al.，2008；Sallese et al.，2009；Hutagalung et al.，2011）。
蛋白质由N-端的信号序列引导进入分泌途径。在共翻译转运中，信号识别颗粒（SRP）识别新生的转运信号序列，翻译终止。SRP指导核糖体-mRNA-多肽三元复合体易位到内质网膜上。这个复合体由多个蛋白质（包括SEC61）形成一个通道，穿过内质网膜。蛋白边转录边易位，分泌蛋白向内质网腔转移的同时，进行翻译后修饰。在胞质中通过SEC62-SEC72-SEC73亚复合体介导进行翻译后修饰活动，同时多肽通过SEC61通道进入内质网腔。
在蛋白质分泌途径中，内质网的重要作用是进行蛋白折叠，使蛋白形成正确的构象，在这个过程中有伴侣分子和折叠酶参与，分子伴侣是一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组分。分子伴侣主要分为伴侣素家族（Chaperonin，Cpn），应激蛋白70家族（Stress-70 Family），应激蛋白90家族（Stress-90 Family）。内质网伴侣分子主要是HSP70家族的成员，该家族成员主要以ATP依赖的方式结合未折叠多肽链的疏水区以稳定蛋白质的未折叠状态，再通过有控制的释放帮助其折叠，参与受损蛋白降解（Parsell et al.，1993），具有耐热性（Sung et al.，2001；Montero-Barrientos et al.，2007，2008）。其中最重要的是BiP（绑定蛋白）。内质网氧化还原传输系统催化形成分泌蛋白的二硫键。另外，分子伴侣hsp70 基因也属于应激蛋白70 家族，是一类分子量约70 KD的高度保守的ATP酶，其功能是提高蛋白对热激和非生物胁迫的耐性（Miersch et al.，2008；Montero-Barrientos et al.，2008），它被称为“细胞温度计”，作为热效应响应的负调节器（Kregel，2002）。Montero-Barrientos 分离到哈茨木霉（T.harzianum）T34 hsp70基因，并通过同源过表达分析其功能，发现其具有耐热性，并能交叉耐受渗透、盐和氧化压力（Montero-Barrientos et al.，2008）。折叠酶属于蛋白二硫化物异构酶家族（PDI）或ERV1家族，通过巯基氧化酶使蛋白正确折叠。脯氨酸顺反异构酶（PPI）是参与蛋白折叠的另外一个折叠酶家族重要成员。
新生的分泌蛋白在转运和折叠过程中被糖基化。通过内质网膜上的寡糖转移酶使核心N-聚糖与天冬酰胺残基相连。内质网有一套完善的质量控制系统，监督蛋白的折叠状态，只允许完全正确折叠的蛋白被转运出内质网。错误折叠蛋白或聚集一起的蛋白均被转移出内质网，并被内质网上的蛋白降解系统降解（ERAD，Bernasconi et al.，2011）。
分泌蛋白经过折叠与糖基化后才能被分泌到细胞外。这个过程有两个转运小泡参与，首先蛋白从内质网转运到高尔基体，再从高尔基体转运到质膜。在这两个过程中，分泌蛋白通过特异蛋白包被被包裹进膜小泡涂层中，这些小泡再随着细胞相关活动被转运到它们的目的地，最终，小泡与靶标膜融合，将分泌蛋白释放到高尔基体或质膜外（Spang，2008）。这些小泡的形成、转运、融合过程是由一种蛋白复合体控制的，这种复合体的数量很多。有一部分蛋白参与全部膜的融合分泌活动——通用融合因子，例如 SEC17和SEC18/NSF蛋白，其余蛋白只是参与某一个步骤，比如SAR1/ARF1型小G蛋白参与小泡分化，Rab 类型小 G 蛋白参与小泡融合（Hutagalung et al.，2011），v-SNARE-和t-SNARE-蛋白分别位于小泡和靶标膜上。SNARE蛋白在小泡到达靶标膜时能互相识别并绑定在一起，能使小泡和靶标膜特异地融合（Malsam et al.，2008；Kienle et al.，2009）。一些大型蛋白复合体（外囊）在小泡与靶标膜融合体在质膜的定位过程中，起到了重要作用，这些蛋白复合体包括 SEC3，SEC5，SEC6，SEC8，SEC10和SEC15（He et al.，2009）。
里氏木霉（T.reesei）是一种嗜温腐生性丝状真菌，具有很好的合成和分泌蛋白的能力，同时具有真核特点的蛋白分泌机制与系统，该机制、系统与哺乳动物的相似，例如高甘露糖型和N-糖基化。对黑曲霉（Aspergillus niger）和里氏木霉（T.reesei）进行的超微结构观察表明，真菌的蛋白分泌途径遵循酵母和高等植物的基本原则（Hemming，1995）（图11.1）。通过转运机制，欲分泌的蛋白质被引向内质网。蛋白分泌过程有信号肽的参与，所有分泌型真菌蛋白质在其N-端附近包含裂解肽；关于木霉分泌性蛋白信号肽情况见表11.1。内质网膜上嵌有负责长醇依赖型蛋白质糖基化的酶，而在内质网腔中则含有负责蛋白质折叠的酶，例如二硫键异构酶（PDI），肽基脯氨酰异构酶（PPI），或者分子伴侣例如BIP或者它们的酵母类似物（Kar2蛋白）。分泌蛋白向内质网腔转移的同时，信号序列丢失，然后进行翻译后修饰，例如O-和N-连接的糖基化，形成二硫键，结构重排以便折叠正确等；有些基因编码折叠酶，或者具有其他酶功能的蛋白，例如O-甘露糖基化，这些现象都在木霉中存在。

图11.1 丝状真菌蛋白分泌示意

T.reesei中蛋白分泌涉及的基因有：hac1，编码UPR转录因子；ire1，编码UPR响应因子；ptc2，编码UPR负调控因子的磷酸盐（phosphatase acting as a negative regulator of UPR）；sec61，编码内质网膜上蛋白转运体系中的主要组件；pdi1，蛋白质二硫化物异构酶；bip1，lhs1，编码内质网中蛋白折叠相关蛋白-伴侣分子HSP70蛋白家族；sar1，编码从内质网向外分泌小泡过程涉及的小G蛋白；ypt1，编码小泡转运进高尔基体涉及的ras型小G蛋白；nsf1，编码小泡融合过程中涉及的通用融合因子；snc1，编码小泡融合到质膜过程中涉及的v-SNARE蛋白；sso1/2，编码小泡融合到质膜过程中涉及的t-SNARE；ftt1/2，编码蛋白分泌途径中最后步骤涉及的14-3-3型蛋白；rho3，编码细胞极性和小泡与质膜融合涉及的ras型小G蛋白
（Saloheimo et al.，2012）

关于木霉分泌途径的进一步了解，来自于氨基酸序列，这些序列从编码分泌蛋白的基因序列推导出来。这些序列合成后作为前体物质，其中包括一个NH2-端信号肽，位于成熟蛋白分子的前面。信号肽结构与内质网信号肽酶的共有序列具有同源性（Gierasch，1989）。大多数含有Kex2-型蛋白酶的裂解位点（表11.1）。

表11.1 木霉分泌型蛋白举例及从核苷酸序列推断的引导肽氨基酸信号序列

注：推断信号序列用黑斜体字母标示（Watson，1984）。下划线部分标示KEX-型蛋白酶的作用位点。成熟蛋白的第一个氨基酸用黑体字母表示。
*表示序列含有典型的KEX2二盐基氨基酸目标基序（Julius et al.，1984）。
从上面数第1～6个蛋白参考Kubicek et al.（1993）；第7个蛋白参考Saarelainen et al.（1993）；第8个蛋白参考Draborg et al.（1996）；第9个蛋白参考Limon et al.（1995）；第10个蛋白参考Garzia et al.（1994）；第11个蛋白参考de la Cruz et al.（1995）；第12个蛋白参考Geremia et al.（1993）。
在T.reesei中发现了一个Kex2-型活性蛋白的存在（Goller et al.，1997）：该酶对二元酸/碱残基有特异性，可特异性地为pAPMSF（p-aminophenylmethylsulfonylfluoride）所抑制，在亚细胞组分中，其分布密度较小。向正在分泌纤维素酶的T.reesei 培养物中加入pAPMSF，可使纤维素酶蛋白分泌立即停止，同时，分子量较大的胞内前体物质大量累积。这种现象表明，对木霉的蛋白分泌来说，Kex2对前体蛋白质的加工十分重要。这些特性与酵母中位于高尔基体上的Kex2-型蛋白酶相似（Redding et al.，1991），由此木霉中前体蛋白的加工过程也发生在高尔基体中。另外，还有研究者发现重组牛凝乳酶能够以活性形式分泌（Harkki et al.，1990），由于激活过程涉及低pH条件下凝乳酶蛋白的裂解修饰，认为分泌途径的其中一段反应发生在具有适当的pH及蛋白酶的细胞器中；免疫学研究已经证明，分泌蛋白存在于液泡中，可以推测木霉液泡参与了蛋白质的分泌。该推测也有一些证据支持，例如在CBHI中检测到了甘露糖-6-磷酸（Maras et al.，1997）。
唐雯等（2008）应用生物信息学的相关工具对T.reesei已公布的9997条蛋白序列进行信号肽和跨膜区的分析，预测出294条分泌蛋白，通过蛋白功能的预测进行分类，发现T.reesei分泌蛋白中有188种水解酶（64%），包括糖苷水解酶114种（38.78%）、蛋白水解酶42种（14.29%）和脂类水解酶11种（3.74%），其中糖苷水解酶占很大比例，包括很多与纤维素（22种）、几丁质（15种）等多糖降解相关的酶，除了已经确定的23条与木质纤维素降解相关蛋白序列之外，还有30条蛋白序列具有潜在的纤维素酶功能；T.reesei分泌型信号肽中疏水氨基酸残基含量最多，大部分是被Ⅰ型信号肽酶识别并切割，且RR-motif很少，双精氨酸分泌系统（TAT）途径可能不存在或作用很小，C区中的信号肽酶识别位点的氨基酸组成相对保守。Adav等（2012）将里氏木霉菌株QM6a和其高产纤维素酶的突变株Rut C-30在天然木质纤维素基质上培养后，研究了胞外蛋白的分泌情况，共定量测定了230个胞外蛋白条带，其中有纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶、蛋白酶、蛋白移位转送因子及假定功能蛋白，发现两个菌株这类蛋白的分泌，都取决于碳源的性质和碳源的复杂程度。

在真核细胞中分泌蛋白进入内质网后，在伴侣分子、糖基化酶和氧化还原酶调控下进行折叠。正确折叠的蛋白被输送到高尔基体，在这里进行蛋白修饰，然后被分泌到细胞外。过量表达的外源蛋白、非正确折叠蛋白、错误折叠蛋白、效率低下的分泌蛋白或其他有害的分泌蛋白的积累，严重影响蛋白的转运和分泌，会对细胞产生压力，比如分泌压力，低产量蛋白或由于细胞接触各种化学品，而抑制蛋白折叠、转运等都会引起分泌压力。

11.1.4.1 非折叠蛋白响应

非折叠蛋白响应（Unfolded Protein Response，UPR）是真核细胞蛋白分泌途径中的一种重要调节机制，是细胞应对分泌压力而出现的一种响应机制。内质网中未正确折叠的分泌蛋白能启动UPR途径（Hetz et al.，2009；Malhotra et al.，2007），当未正确折叠蛋白在内质网中累积时，编码内质网折叠蛋白和伴侣分子的基因、编码内质网相关蛋白降解途径的基因和一部分转运蛋白基因及糖基化相关基因将被诱导表达。研究发现T.reesei中UPR途径及其激活机制与其他生物的既有相似又有不同之处。

当内质网中未正确折叠蛋白积累时，它们结合内质网中伴侣分子BiP，少量BiP与IRE1蛋白内质网膜上的IRE1蛋白绑定时，就会激活UPR途径。IRE1蛋白激活时进行磷酸化。在T.reesei中过表达IRE1时，大量相关基因的转录水平提高，有pdi1，内质网伴侣分子基因bip1和lhs1，糖基化途径基因pmi40，转运通道基因sec61和脂类生物合成基因ino1。这说明UPR涉及很多基因。在T.reesei中表达抗体的Fab片段将会导致pdi基因表达的明显上调，这可能是由于外源蛋白在内质网的积累引发UPR后造成的（Saloheimo et al.，1999）。T.reesei中编码磷酸酶，使IRE1 蛋白去磷酸化，消除UPR响应的基因ptc2已经被克隆（Valkonen et al.，2004）。

介导UPR的蛋白是HAC1（Cox et al.，1996），T.reesei的hac1基因和构巢曲霉（Aspergillus nidulans）hacA基因已经被克隆，发现激活UPR的是具有20个核苷酸的内含子拼接到hac1/A mRNA上（Saloheimo et al.，2003）。Hac1/A mRNA在5’端区大约有200个核苷酸被截断，同时上游开放阅读框架（uORF）从 mRNA 上脱离。这说明 T.reesei 中hac1/A是通过双重机制诱导表达的，内含子剪接恢复成一个活跃的开放阅读框，不使用常规翻译开始位点的uORF，用另一个转录起始点替代。

细胞中感受未折叠蛋白的是一个ser/thr跨膜激酶Irelp，它能检测到未折叠蛋白的聚集，并将信号传递到细胞核内，诱导UPR特异转录因子HAC1mRNA的非传统性剪接。在UPR响应发生时，IRE1的N-端感受信号，并多聚化激活C端的蛋白激酶和RNase活性，然后进一步激活下游转录调控因子HAC1。VoIkonen（2003）克隆了T.reesei中的ire1基因，发现其与S.cerevisiae中的IRE1 功能同源，他同时在T.reesei中过表达ire1，发现ire1能诱导一些内质网伴侣分子和折叠酶的表达。

转录调控基因hac1可结合到UPR功能基因pdi1等基因的上游启动转录。丝状真菌中HAC1mRNA剪切过程是5’端区域被截短并除去20nt的内含子。HAC1因子入核后结合在UPR响应基因启动子区的非折叠蛋白响应元件区域，促使UPR相关的折叠酶、伴侣分子和糖基化修饰酶等的表达，以实现对内质网压力的响应。内质网压力响应与内质网相关蛋白降解途径（ER-Associated Protein Degradation，ERAD）是紧密相连的，ERAD可将错误折叠或未组装的蛋白直接导入蛋白酶体被26 S巨大蛋白酶降解。

HAC1为UPR途径中重要的调控转录因子，当蛋白质在内质网积累，跨膜感受器将刺激信号传递给HAC1，然后激活UPR途径，提高分子伴侣和折叠酶的表达。在UPR途径中具有重要作用。HACA属于bZIP型家族的转录因子，它在DNA结合结构域下游含有一个典型的亮氨酸二聚体基序结构。研究显示，hac1及其靶基因pdi1，bip1（编码二硫键异构酶、蛋白折叠伴侣）在低生长速率下出现诱导转录，说明低生长速率下蛋白分泌受到了限制（Pakula et al.，2005）。而且，pdi1，bip1的转录也与纤维素酶基因一起受到乳糖、槐糖的诱导（Foreman et al.，2003）。这都说明，即使不添加外源蛋白折叠抑制剂（例如二硫苏糖醇DTT），蛋白分泌压力的提高也可使蛋白折叠过程做出应答。同样，在T.reesei中hac1/hacA基因也通过一个由UPR诱导的非常规内含子的剪切机制进行剪接（Saloheimo et al.，2003）。这些实验结果都显示在丝状真菌中表达外源蛋白将会造成UPR响应并使相应的伴侣分子和折叠酶的表达上调，目前的研究表明这些变化是由上游的IRE1和HAC1调控的。

最近，在研究蛋白折叠和分泌抑制剂对T.reesei的影响时，发现一种新的分泌压力响应机制（Pakula et al.，2003）。该途径在有分泌压力时发挥作用，下调一些基因的转录水平。只有正确折叠的蛋白被转运到高尔基体，进一步修饰，调整蛋白的功能和稳定性。用DTT，BFA或者能打破Ca²⁺平衡并抑制蛋白折叠或者蛋白转运出内质网的A23187处理细胞时，纤维素酶和木聚糖酶主要编码基因的转录水平迅速降低，导致这些蛋白合成量迅速降低。当用DTT处理携带标记基因的完整cbh1启动子或在上游161位点断裂的cbh1启动子的菌株时，标记基因的mRNA量并没有减少，这说明基因调控发生在转录水平，并在上游161位点以后。这种分泌压力响应机制只在 T.reesei和A.niger 中被检测到（Al-Sheikh et al.，2004），这点不同于其他丝状真菌。这种新的途径被称为RESS（REpression under Secretion Stress），认为内质网中在基因转录水平终止新蛋白合成，处理未折叠蛋白的另一种新方式。目前已经有400余个和蛋白分泌压力响应有关的基因被鉴定。

11.1.4.2 突变体

Suh等（1986）和Byers（1981）在尝试分离T.reesei的温度敏感型突变体时发现sec突变体的分离程序基于酵母的单细胞特点，而不适合于多细胞的生物体。在一系列ts突变体中，共有两大类型：突变体为温度敏感型的，在37℃能生长；突变体能在37℃正常生长但其萌发需在25℃。b类突变体在37℃分泌的蛋白质量很少。但是，与酵母的sec突变体不同，生长对温度的敏感性与蛋白分泌障碍之间没有直接关联。当有2-脱氧葡萄糖存在时，T.reesei的一些突变菌株可以在纤维二糖为碳源时产生纤维素酶，而这些突变菌株是超分泌型的，例如菌株 RUT C-30和RL-P37（Eveleigh et al.，1979；Mandels et al.，1976；Merivouri et al.，1987）。当初使用这种筛选方法的目的是想得到碳源分解物阻遏型的突变菌株［在基因水平上已被Ilmen等（1996）所证实］，但生物化学研究表明，这些突变体中也发生了其他一些变化，包括粗糙内质网及粗糙内质网衍生的泡囊等细胞结构的大量增加（Ghosh et al.，1982，1984）。另外，通过亚细胞组分分析，在T.reesei突变体RUT C-30的增生内质网上还发现了一些酶的活性（Glenn et al.，1985），这些酶一般存在于其他真核生物的高尔基体中。由此可以判断T.reesei菌株RUT C-30是一个内质网发生突变的菌株。在功能上，现在还不知道该突变是否与碳源分解物阻遏基因cre1相关（Ilmen et al.，1996）。

魏松环等（2009）克隆了T.reesei内质网压力响应途径中的调控蛋白基因hac1和分子伴侣基因hsp70，成功地进行了T.reesei转化。对表达hsp基因的转化子T47-hsp和T112-hsp的胞外分泌蛋白总量进行了检测，相对于各自的出发菌株 T47和T112，T47-hsp和T112-hsp的胞外蛋白分泌总量有一定程度降低，但对胞外分泌蛋白CBHI活力测定结果显示：T47-hsp和T112-hsp菌株 CBHI 酶活均比出发菌株有提高，说明过量表达分子伴侣HSP70可提高内源蛋白的分泌量。

液泡蛋白分选受体基因vps10编码类型I跨膜受体蛋白，有四个保守结构域，是完成运输功能所必需的。通过与GFP融合表达观察到Vps10p主要位于高尔基体和液泡前体。尽管Vps10p能够识别几种重组体蛋白及异常蛋白并靶向运输至液泡降解，但是它对外源蛋白的产量的影响尚被知之甚少。为了研究里氏木霉（T.reesei）蛋白分泌途径中的液泡蛋白分选受体vps10 基因的功能，于海娜（2011）利用基因敲除技术构建了里氏木霉（T.reesei）vps10基因缺失菌株，并对其进行了生长和产酶分析。发现基因缺失菌株的生长状态与野生型菌株基本一致，生物量略有提高，对纤维素酶的分泌影响不显著。在Yoon（2010）最新的研究中，在米曲霉（Aspergillus oryzae）中破坏AoVps10基因，使外源蛋白CPY和HLY产量分别提高了3倍和2.2倍。这是首次关于破坏一个液泡分选受体基因而导致外源蛋白产量提高的报道。

11.1.4.3 细胞膜和细胞膜组分对木霉蛋白分泌途径的影响

有些丝状真菌，如果向培养基中加入去污剂例如吐温-80，脂肪酸或者磷脂，其产酶能力能够得到提高（Reese et al.，1969，1971）。这种效应的生物化学基础，应是通过刺激分泌途径中的限制性环节表现出来的，向T.reesei培养基中加入胆碱或者吐温80，都能够促进质膜增长及蛋白质的分泌（Schreiber et al.，1986）。另外，电子显微镜检查、化学成分分析及标志性酶分析表明，含胆碱培养基中生长的木霉菌丝中线粒体和内质网的含量也比对照有增加。因此，胆碱对蛋白质分泌的促进效应，可能与蛋白分泌有关的细胞结构“瓶颈”存在关联，其机理与RUT C-30突变有一定程度的相似性。用脂肪酸处理也能促进蛋白质的分泌，其过程和机理与此相似（Panda et al.，1987）。

小泡在分泌途径的各个步骤中都起着重要作用，因此，质膜的流动性也应在蛋白质的分泌中有一定影响。为了证明这个假设，有人研究了一些影响质膜完整性或者流动性的因子。Merivouri等（1987）发现，2%（v/v）的乙醇能够抑制 T.reesei 超分泌型菌株 RL-P37的纤维素酶分泌，但对其亲本菌株没有影响。令人感兴趣的是，分泌蛋白的糖基化方式也因为乙醇的加入而发生改变。但也有不同的报道，Haab等（1993）发现T.reesei RUT C-30的蛋白分泌对乙醇的耐受性显著高于亲本菌株。对乙醇耐受性的这种差异在糖基化蛋白（CBHI和CBHII）及非糖基化蛋白（木聚糖酶Ⅱ）中均被发现，表明乙醇不影响糖基化相关步骤。Northern分析表明，乙醇还能减少纤维素酶mRNA的数量，因此能够干预纤维素酶基因的转录。这些研究者解释，对乙醇的高度耐受性源于细胞质膜固醇成分的改变，而这种改变又与筛选突变体时所用培养基中含有胆酸有关。Gorka-Niec等（2010）发现1M山梨糖醇对T.reesei蛋白质分泌有很大影响，减少将近10倍分泌量。

分泌蛋白和膜蛋白是通过依赖SNAREs的胞外分泌途径到达质膜，SNAREs的作用是保证介导运输小泡与目标膜特异融合，位于运输小泡上的叫作v-SNAREs，而位于靶膜上的为t-SNAREs。v-SNAREs和t-SNAREs 特异性识别结合后形成 SNAREs 复合体（trans-SNAREs Complexes），并通过这个结构将运输小泡的膜与靶膜拉在一起，实现运输小泡特异性停泊和融合。T.reesei 具有两个质膜突触融合蛋白样 t-SNAREs受体-Ssolp和Sso2p，Ssolp与次顶端质膜上的受体v-SNARE Snclp结合而Sso2p则与顶端质膜上的受体Snclp结合，考虑到菌丝的生长区主要在顶端，Sso2p可能主要含有与菌丝的顶端生长有关的物质例如细胞壁合成的酶类，而Sso1p则负责水解酶类及膜蛋白的运输。

液泡蛋白在高尔基体中被分选出来并通过内含体运输到液泡中，液泡对维持细胞质流动性、蛋白水解、分选及细胞间的转运有重要的作用。

胞外分泌物质和膜蛋白都是通过内吞作用实现的，内吞的蛋白在早期的内涵体内被分选出来，经过反向循环被带到质膜，或者通过晚期的内涵体进行降解。v-SNARE Snclp就是一种最后经过反向循环又回到质膜的蛋白，内吞泡对维持胞外蛋白的分泌和膜质的极性又有非常重要的作用，虽然其间接作用于蛋白的分泌过程，却起着关键作用。

11.1.4.4 碳源、pH、温度等环境因素对木霉蛋白分泌途径的影响

Suarez等（2005）研究了分别以几丁质、其他真菌细胞壁为碳源时，T.harzianum的分泌蛋白质表达情况。研究发现，在不同的培养条件下胞外蛋白组存在显著差异，但一种新型的天冬氨酸蛋白酶的表达量是最高的，因而猜测这种蛋白质在其腐生生活中起主要作用。研究结果还发现，两个菌株除了在分泌量上的差异之外，纤维素酶的组成上有明显的差异。T.reesei CL847分泌至胞外的蛋白种类较多，而T.reesei RUT C-30 则倾向于只分泌纤维素酶。Monteiro（2010）分别在含有菜豆壳球孢菌（Macrophomina phaseolina），镰刀菌（Fusarium spp.）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）病原真菌细胞壁的培养液中培养T.harzianum ALL42，提取胞外蛋白。经双向蛋白电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术检测分析，在这3种培养液中共发现60种分泌蛋白，其中7种蛋白是细胞壁诱导蛋白，分别是内切几丁质酶、β-葡糖苷酶、a-甘露糖苷酶、酸性磷酸酶、a-1，3葡聚糖酶和蛋白酶，这些酶在培养液上清中也能被检测到。其余53种蛋白未鉴定出来，可能是新蛋白或是还未被测序的蛋白。

伍红（2011）发现T.reesei QM9414在发酵培养过程中的胞外分泌蛋白的总量变化与其培养液中碳源的成分有着密切的关系。在纤维素、木聚糖、乳糖、甘油、葡萄糖等不同碳源条件下培养QM9414，对纤维素酶、木聚糖酶的活性差异及其培养液中总分泌蛋白的表达差异进行了分析。发现纤维素、乳糖和木聚糖均可诱导纤维素酶和木聚糖酶的合成；而葡萄糖是两种酶合成的抑制性碳源。其中，以纤维素和乳糖为碳源的培养液中，蛋白合成的速度及总量都显著高于其他碳源，其次是以木聚糖为碳源的培养液，再其次是甘油为碳源的培养液，蛋白质合成速度及总量都很低的是葡萄糖为碳源的培养液，说明碳源对T.reesei蛋白质合成代谢的调控作用很明显。纤维素、乳糖、木聚糖都可以诱导胞外分泌蛋白质基因表达。从蛋白合成总量来看，纤维素和乳糖的诱导能力强于木聚糖，与以前的报道一致（Suto et al.，2001；凌敏等，2009）。柳常青（2009）发现T.reesei在以葡萄糖或甘油为碳源时仅 CBHII，BXL和AxeI 3种纤维降解酶有微量表达，这3种酶可能是T.reesei组成型表达的纤维降解酶。纤维二糖能够诱导CBHI，CBHII，EGI，EGIII，BXL，AxeI和AglI 较高水平的表达。纤维素纸浆可诱导 CBHI，CBHII，EGI，EGII，EGIII，EGIV，ManI，ManII，AxeI，BXL和AglI等11种酶的大量表达，表达量占分泌组的61%。纤维素诱导的纤维降解酶组分比例情况与纤维二糖条件很相似，但表达量和酶活性都有显著上升。不少报道也证明了这点（Wrleitner et al.，2003；Mach et al.，1996）。

除了碳氮源外，pH是影响微生物产酶量的主要因素，它对代谢通路、工业产酶量和酶合成效率都有影响。据报道，T.reesei在不同pH时的蛋白分泌量有很大变化。Sunil等（2011）发现 T.reesei 野生菌株（QM6 a）及其突变体（QM9414，RUT C-30，QM9414MG5）这4个菌株中，纤维素水解酶包括纤维素内切酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶在不同pH培养基中表达水平都有变化。对在不同pH培养基中特异表达的蛋白进行聚类分析，发现 T.reesei 野生菌株（QM6 a）及其突变体（QM9414，Rut-C30，QM9414MG5）分泌酶类所占比例相似，但明显随着pH的变化和菌株的不同而表达量不同。在pH为9.0时，T.reesei菌株QM6 a和RUT C-30降解纤维素效率明显降低，具有较低的酶活性，细胞生长速度明显降低；RUT C-30菌株在pH为4.0时纤维二糖水解酶I和外切葡聚糖酶Ⅱ的蛋白丰度最大，这表明这两种酶的表达水平最高；而内切葡聚糖酶Cel74a，β-1，3-葡聚糖酶，β-葡聚糖酶等蛋白在pH为5.0时表达量最高；在pH在3～5之间时纤维素水解蛋白的丰度明显较高，纤维素降解能力相应增强。半纤维素水解酶包括GH11内切1，4-β-木聚糖酶、GH11木聚糖酶III、GH54 阿拉伯呋喃糖酶、GH5β-甘露聚糖酶、GH43木糖酶/阿拉伯糖苷酶，GH39 β-木糖酶、GH5 内切β-1，6-半乳聚糖酶、植酸酶等在不同pH环境中都能检测到。pH在3.0～7.0 范围内T.reesei和突变体产半纤维素降解酶量并没有受到明显影响，在酸性条件下，半纤维素水解蛋白的分泌量最大。木聚糖酶Ⅰ～Ⅳ中木聚糖Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别在pH为4.0～4.5，4.0～6.0和6.0～6.5时分泌量最大（Tenkanen et al.，1992 a；Torronen et al.，1995；Xu et al.，1998；Sunil et al.，2011）。在碱性条件下各类纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解蛋白、肽酶、几丁质酶和运输蛋白的分泌量均受到显著影响。

在木霉菌株培养过程中，经常是碳源与培养基的pH协同作用于木霉菌的蛋白分泌表达，Bailey等（1993）发现T.reesei RUT C-30在pH为7.0时木聚糖酶分泌量最大，而在以纤维素和木聚糖作为主要碳源时纤维素酶在pH为4.0时分泌量最大。Xiong等（2004）报道T.reesei在乳糖培养基中培养时，木聚糖酶I在pH为4.0、木聚糖酶Ⅱ在1 pH为6.0时分泌量达到最大。

培养温度对木霉纤维素酶的分泌量来说很重要，而且温度效应具有菌株特异性。Merivouri等（1990）发现在28℃培养时，T.reesei RUT C-30的纤维素酶产量为亲本菌株的3倍，而在30℃培养时则仅为2倍。利用酶活性分析及电泳技术发现，温度的升高能够减少纤维素酶但能增加木聚糖酶的分泌量，这种效应对T.reesei亲本菌株QM9414和突变菌株RUT C-30来说是相似的。T.reesei QM9414 内切葡聚糖酶的分泌速率在17℃培养时提高，接近菌株 RUT C-30在 28℃培养时的分泌速率。Suh等（1986，1988）比较了T.reesei QM6 a和T.reesei RL-P37在25℃，30℃和37℃培养时的木聚糖酶和内切葡聚糖酶分泌情况，发现低产量菌株QM6 a在较高温度培养时蛋白质分泌量下降，但菌株RL-P37的产量却有所提高；但两个菌株的木聚糖酶活性在高温培养时都得到了提高。

11.1.4.5 细胞壁在蛋白质结合与释放中的作用

在快速生长期，真菌的许多胞外蛋白质在分泌以后结合在细胞壁上，木霉的一些分泌型蛋白质也存在这种现象。Kubicek（1981，1982，1983）利用β-葡糖苷酶作为模式，研究了木霉分泌型蛋白与细胞壁的结合情况，发现分泌型酶总活性的80%与细胞壁有关联（Kubicek，1981），细胞壁也是限制商业纤维素酶产量的因素。β-葡糖苷酶对细胞壁的结合程度与细胞壁成分及更新动态有关。与β-1，3-葡聚糖酶或者几丁质酶共培养时，β-葡糖苷酶能够释放出来，如果木霉细胞壁中含有高水平的β-1，3-葡聚糖酶，总β-葡糖苷酶分泌量增加的部分即出现在培养液上清中（Kubicek，1982）。另外，在山梨糖（同质异形诱变剂）存在时，木霉在生长过程中向培养液中的释放β-葡糖苷酶量可被提高（Ku-bicek，1983；Nanda et al.，1986），已知山梨糖能够抑制β-1，3-葡聚糖的合成。这些研究结果都支持如下假设：即细胞壁中的β-1，3-葡聚糖组分参与β-葡糖苷酶对细胞壁的结合。然而，在细胞壁酶解过程中，细胞壁中仍有多糖与β-葡糖苷酶紧密结合，通过对这些细胞壁多糖成分的纯化分析，发现β-葡糖苷酶与复杂的异型多糖有关联，这些多糖由甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸组成（Messner et al.，1990a）。有趣的是，这种异型多糖在细胞壁中能够结合β-葡糖苷酶，但在体外则能够激活β-葡糖苷酶。经过核磁共振技术（NMR）分析，发现这种能够激活β-葡糖苷酶的异型多糖结构骨架为线形的a-1，6-D-甘露聚糖（Rath et al.，1995）。

Perlińska-Lenart等（2006a）将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）编码长醇基一磷酸甘露糖合成酶的dpm1基因转到T.reesei中获得超量表达，结果提高了蛋白质糖基化强度和分泌量，而且引起了木霉细胞壁的超微结构变化。在化学组成方面，细胞壁中的N-乙酰基葡萄糖的含量增加，暗示几丁质含量提高，用荧光增白剂（Calcofluor White）染色后发现几丁质在细胞壁中的分布也发生了改变。还发现甘露糖及碱溶性β-1，6葡聚糖的含量减少。通过比较原生质体与菌丝的蛋白分泌情况，发现转化子的细胞壁是蛋白分泌的一道屏障，阻碍了蛋白分泌。分泌蛋白糖基化水平的提高，减少了核糖量，从而限制了细胞壁多糖的合成，但甘露糖及碱溶性β-1，6葡聚糖的含量减少又使得细胞壁的孔隙率提高，反而有利于蛋白质的分泌。

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