如何利用分光光度计测量dna样品的浓度和纯度？还有其他方法？他们之间有什么区别？
首先,分光光度计测量的样品必须是均一的,摇匀后再测量结果会准确些.它是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器.
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能.可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA.核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm.每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同.定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数.如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig.测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度.测试前,选择正确的程序,输入原液和稀释液的体积,尔后测试空白液和样品液.然而,实验并非一帆风顺.读数不稳定可能是实验者最头痛的问题.灵敏度越高的仪器,表现出的吸光值漂移越大.
事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度.如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%（1A）.这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动,都是正常的.另外,还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值,离子浓度等：在测试时,离子浓度太高,也会导致读数漂移,因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液,如TE,可大大稳定读数.样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品.这些小颗粒的存在干扰测试效果.为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A.在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定.从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高（超过光度计的测试范围）.最后是操作因素,如混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值；混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项.
除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm.纯净的样品,比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）.如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响.A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0.A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子.纯样品,A320一般是0.
分光光度计
分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸在波长 260 nm处有最高吸收峰。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
核酸的定量
DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处，每种核酸的分子构成不一， 因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / ml 的dsDNA，37μg / ml 的ssDNA， 40μg/ml的RNA，30μg/ml的寡核苷酸。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度，这些由分光光度计内预设的程序执行，因此，测试前选择正确的程序，测试样品的类型，首先测试空白液，然后再测试样品，注意输入样品稀释倍数。
如何避免吸光值漂移
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器， 表现出的吸光值漂移越大。事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
核酸本身物化性质
溶解核酸的缓冲液的pH 值、离子浓度等
在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。核酸的吸光值受pH值和缓冲液离子浓度影响。只有在一定的pH值和低离子浓度的条件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0），才能得到精确的检测结果。水的pH值不稳定，可能导致检测误差。一些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收，为了确保准确测量，请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。
样品的稀释浓度
同样是不可忽视的因素，由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
操作因素
如混合要充分，否则吸光值太低， 甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
各波长具体含义及相关问题1. A260nm
是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。DNA样品的A260 吸光度值是否>0.1。（请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值<0.1）；
朗伯－比尔定律：
A 吸光值
I0 入射光强度
I 投射光强度
c 吸光物质的摩尔浓度（mol/L）
d 光通过的液层厚度（cm）
ε 摩尔吸光系数（Lmol-1cm-1）
2. A280nm
是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50％蛋白质/DNA溶液
3. A230nm
是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A230产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。
4. A320nm或A340nm
为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。纯样品的A320一般是 0。
5. A260/A280和A260/A230
是核酸纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值应该在2.0 或2.5，A260 / A280的比值， 用于评估样品的纯度， 因为蛋白的吸收峰是280 nm。 纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 。A280是蛋白质的吸光度。
另，基因组DNA1％的琼脂糖凝胶电泳检测均呈现完整清晰条带没有拖尾，说明 DNA 样品的完整性好，也可通过DNA marker 推算出DNA浓度。
索士康乐： 一般用微量分光光度计比较快速简便,DNA浓度会直接在软件上显示,A260 / A280的比值用于评估样品的纯度, 纯净的样品比值大于1.8,低于2.0.较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0.
龙山区19847811478： 怎么用可见紫外分光光度计测定样品? - ？
索士康乐： 第一步,知道你所需要测量物质的特征吸收波长是多少?这个可以在国家标准、行业标准或其他相关标准或方法.例如测量总氮的话,就需要220和275nm这2个波长,所以必须买紫外的光度计,并且最好带双波长测定功能,例如测总磷是697...
龙山区19847811478： 怎样利用分光光度计法测定质粒DNA的图谱,求详细实验步骤,谢谢 - ？
索士康乐： 将dna纯化后,结晶.生成晶体后(你可以想象成像食盐颗粒一样的东西,只不过还要小的多),使用同步辐射x射线投射到dna晶体上,x射线将产生衍射,衍射符合布拉格公式.我们不能从衍射图谱中“看出”,而是根据这个图谱加之布拉格公式计算dna的结构. 伦敦国王学院的威尔金斯、弗兰克林实验室,他们用x射线衍射法研究dna的晶体结构.当x射线照射到生物大分子的晶体时,晶格中的原子或分子会使射线发生偏转,根据得到的衍射图像,可以推测分子大致的结构和形状.
龙山区19847811478： 如何使用简单的实验方法检测DNA纯度 - ？
索士康乐： 实验原理DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处.因此,可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA.如用25px光径,用 H2O稀释DNA/...
龙山区19847811478： 如何用紫外分光光度计测定鲑鱼精DNA的浓度? - ？
索士康乐： 首先,分光光度计测量的样品必须是均一的,摇匀后再测量结果会准确些.它是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器. 核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能.可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA....
龙山区19847811478： 测定DNA含量用什么方法? - ？
索士康乐： 组成核酸分子的碱基,均具有一定的吸收紫外线特性,最大吸收值在波长为250~270nm之间.核酸的最大吸收波长是260nm,这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础. 在波长260nm紫外线下,1OD值的光密度相当于双链DNA...
龙山区19847811478： 测定DNA含量可以用什么方法? - ？
索士康乐： 外分光光度计 OD260/280比值,如果浓度够大的话可以适当稀释,是OD260在0.1到1之间最好. OD260值为1时,双链DNA一般为50ng/ul.单链DNA一般为40ng/ul,需要具体测的话还是用荧光定量DNA检测试剂盒,用多功能酶标仪检测. 还有一种就是跑电泳,根据已知浓度条带的亮度对比你提的DNA亮度,这个需要分析软件,肉眼是无法正确比较的.
龙山区19847811478： DNA含量的测定方法 - ？
索士康乐： 那要看你用什么方法测定DNA和RNA: (1)紫外吸收法也就是测量OD(260)和OD(280)的吸收值,这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点,因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收. (2)荧光法,用PicoGreen荧光染料,测定DNA,RNA浓度比较灵敏,并且适合测量低浓度和微量DNA和RNA,并且受其它杂质的影响不大,缺点要有专门的荧光检测仪器,试剂比较昂贵. 纯化DNA可以买试剂盒,主要有膜吸附法,磁珠分离法,都很方便.
龙山区19847811478： 如何根据230nm289nm260nm的吸光度判断已提取纯化的DNA的浓度和纯度 - ？
索士康乐： 紫外吸收检测DNA浓度与纯度2007年11月13日 星期二 11:40目的: 了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理,掌握测定方法.原理: 核酸的最大吸收波长为260nm,蛋白质为280nm,在波长260nm时,1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml,...
龙山区19847811478： 如何使用简单的实验方法检测DNA纯度? - ？
索士康乐：[答案] 用紫外分光检测就很简单啊 将待测DNA溶液作适当稀释,选用光程为0.5cm的石英比色杯,在紫外分光光度计上测定OD260和OD280的值,按以下公式计算DNA浓度. DNA浓度(ng /µL)=OD260*50*稀释倍数 当OD260/OD280当OD260/OD280> ...
