如何提高FFPE DNA建库质量
FFPE（Formalin-Fixed and Parrffin Embedded），即福尔马林固定石蜡包埋样本。由于这种处理方法能够较长时间地保存组织或制备检验所需的组织标本，所以在临床病理检验、肿瘤基因检测中应用广泛。在世界范围内，大约有数十亿份组织样品保存在医院或者组织样品库中，其中绝大多数是使用福尔马林固定石蜡包埋的方法处理的样品。
FFPE样本通常代表了珍贵且来源广泛的生物医学研究材料，为阐明疾病机制、回顾性研究等提供了宝贵的资源，但是由于样本制备以及储存等多方面的原因，FFPE样本中的DNA质量往往很差。所以如何通过FFPE样本中获得的DNA建立合格的文库已成为当前测序研究领域亟待解决的问题。
FFPE样本特殊的制作方法和保存过程都会对核酸分子造成多方面的影响。组织医学样本在离体后即开始发生降解，福尔马林的固定使组织中的核酸与核酸或核酸与蛋白之间交联，石蜡的渗入过程进一步加速核酸的降解，保存时间及环境对样品中的核酸也有极大的影响。上述这些原因最终导致样本中的核酸质量受到严重的干扰和影响，比如假阴性和假阳性。其中假阳性的出现对于基因检测，尤其是低频突变的检测会造成很大的干扰。
表1、影响FFPE样本中DNA质量的主要因素
对于高质量的DNA样本，通过吸光度检测样品纯度（Nanodrop）和荧光定量（Qubit）进行质量检测即可，但是这对于FFPE样本来源的DNA是远远不够的， 需要进一步的质控评估。目前主要的方法有以下两种：
表2、FFPE样本质控参数
FFPE样本由于制作与储存等多方面的原因导致样本质量不佳，如果质控之后样本质量很差，可对样本DNA进行修复。通常修复液由不同的酶类根据不同比例混合而成，能够对DNA样本中胞嘧啶脱氨成尿嘧啶、切刻或者缺口等问题能够进行修复，进而从整体上提升建库成功率。
表3、FFPE 修复试剂作用
通常情况下，FFPE修复试剂可以通过对样本的修复显著 提高低质量FFPE样本的建库产出 ，而对高质量FFPE样本的建库产量提升并不明显（如下图所示）。
高效的建库试剂盒能够最大程度的利用有限的样本，使其转化为合格的文库。FFPE样本由于样本浓度更低，质量较差，往往对试剂盒的要求也更高，搭配更高效的建库试剂盒也成为了FFPE样本建库的必备之选。
建库试剂盒的效率评估指标主要3个方面：
NGS建库文库转化率：
指文库中两端都连上接头的目的片段占总片段数的比值。文库转化率影响文库的多样性与文库的质量，高的文库转化率一定程度上意味着文库丰度与测序的覆盖度更好，尤其是在FFPE样本中可能出现一些其他类型损伤的情况下，转化率过低势必会影响最终文库的产出与文库的丰度。
文库扩增均一性：
指的是读取数据在基因组或目标区域的分布均一程度。一般认为覆盖越均匀，达到特定深度所需的测序数据就越少，覆盖均一性的偏向通常是在DNA片段化和文库扩增步骤中引入的。
文库扩增效率与保真性：
文库扩增效率即获得特定文库产量所需的循环数，循环数越低意味着扩增效率越高；保真性即PCR扩增中出现碱基错配的数量，相同循环数条件下，错配数量少则保真性越高。
Hieff NGS® Ultima DNA Library Prep Kit（Cat#12199）是翊圣生物针对Illumina测序平台研发的高效DNA建库试剂盒，本品采用高质量酶学组成，具有优异的文库转化率与扩增效率，彻底解决FFPE/cfDNA建库难的问题。适用于常规动植物基因组、微生物基因组、FFPE、cfDNA、ChIP DNA等所有样本建库，助力获得优异的测序数据。
精简流程： 末端修复与A尾巴添加一步完成，无需纯化，大大缩减建库时间；
极高效的DNA连接酶： 自主创新研发高效DNA连接酶Fast T4 DNA Ligase，多样本验证连接效率是N*品牌的2-3倍；
文库产量高： 多样本类型验证，同等条件下文库产量是K*品牌的1-3倍。
强扩增效率的高保真酶： 自主创新研发强扩增效率高保真酶Canace®Ⅱ，极大降低文库扩增带来的偏好性。性能媲美K 品牌H Fi酶；
东郭彭贝感： rtpcr时提取rna的浓度和纯度要求:浓度20ng/ul以上足够了,如果用的是组织提取,浓度一般很高,可以达到几百甚至几千.如果你用的是病毒、少量细胞,浓度低一些也没有关系. 纯度需要用仪器测一下.260/280理论值应该有2.0以上,260/...
三都水族自治县18096653926： 如何从石蜡切片组织中提取RNA - ？
东郭彭贝感： 如何从石蜡组织切片(FFPE)中提取DNA 这个要根据你的实验目的和想要达到的效果来选择,各有千秋.我之前因为实验问题,在网上咨询过中洪博元,我整理一些给你参考下: 1.从一抗的选择方面来看.有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻...
三都水族自治县18096653926： 微生物基因建库怎么做 - ？
东郭彭贝感： cDNA 文库的构建 1.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合.经典 cDNA...
三都水族自治县18096653926： 高通量测序DNA质量很好,为什么建库失败 - ？
东郭彭贝感： 建库失败具体指什么,文库的片段不符合大小,还是文库质量太低.另外你的文库的样本类型是什么? 首先要检查实验步骤,确保完成了接头添加.试剂没有加错,另外就是扩增的时候要注意.
三都水族自治县18096653926： 如何降低DNA建库的成本 - ？
东郭彭贝感： 这个是个很大的工程,靠国家的力量才能完成. 1 投入研究提高光伏电池转换效率 2.增加太阳能装机容量,从而增加太阳能板生产量量,降低太阳能电池单位成.本. 比如出台鼓励措施,国家补贴措施,鼓励个人建立分布式太阳能. 3, 尽量在太阳能资源丰富的地区建立光伏发电,提高发电量. 4. 尽量使用多晶硅或非晶硅电池板 总之,目前能做的就是增加使用量,从而降低光伏板生产成本,最终降低发电成本.
三都水族自治县18096653926： DNA建库时末端修复后要加A,它是具体怎么做到只加一个A的?(注意是具体) - ？
东郭彭贝感： Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能,PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端.只有用经过特殊处理的具有3'-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接. 所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物,不需将PCR产物进行优化,不需把PCR产物做平端处理(Invitrogen另有平端载体供高确限度酶克隆).不需在PCR扩增产物上加接头,即可直接进行克隆. 可以用超声波进行DNA的打断!
三都水族自治县18096653926： 样品质量不完全满足建库测序要求 怎么办 - ？
东郭彭贝感： 三代对于DNA有两方面的要求,首先是DNA的量,一般对于Pacbio RSII的P6-C4建库测序方式对于一个样本的DNA量都要求10ug以上总量.此外DNA的质量值也对测序结果有很大影响.影响最大的还是DNA长度,原始DNA长度直接决定最后测序获得的sub_reads的读长.P6-C4可以获得长至30kb的reads,所以原始DNA最好长度至少大于10kb以上.OD值一定程度上可以反映DNA的质量和纯度情况,如果DNA中含有如蛋白或盐离子甚至次生代谢物都会对Pacbio的测序产生影响.表现在测序数据量底下,甚至只有正常的十分之一数据.
三都水族自治县18096653926： DNA建库时末端修复后要加A,它是具体怎么做到只加一个A的?(注意是具体)另外,DNA打断机在片段长度的具体打断时,打断长度跟打断频率、打断时... - ？
东郭彭贝感：[答案] Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能,PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端.只有用经过特殊处理的具有3'-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接. 所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物,不需将PCR产物...
三都水族自治县18096653926： 如何从石蜡组织切片(FFPE)中提取DNA - ？
东郭彭贝感： BIOG DNA FFPE Tissue Kit采用进口离子膜吸附DNA,大多数蛋白质、多糖和脂类物资则被去除,提取得到的DNA纯度更高,可以直接应用于各种PCR、Southern Blotting和限制性酶切实验等.
三都水族自治县18096653926： 孕14周进行了无创DNA检测,一直没有结果,去医院查显示重新建库,重新 - ？
东郭彭贝感： 重新建库的原因有几种,一种是本身DNA不好,需要重新抽血进行实验,但是如果没有通知你重新抽血的话可能就是一种是他那边首次实验没有做好,重新...
