怎么用跑胶软件测 目的基因和内参的半定量 比值
半定量pcr内参基因扩增条件和目的基因扩增条件一样
以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本 中靶基因的拷贝数,称为定量PCR.根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增,定量PCR可分为四种：
①有限稀释法,即倍比稀释法：通过稀释阳性样品直至靶基因不能再扩增为止,来设置已知浓度的参照品；根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线,计算出待检标本中原始模 板的分子数；利用最大稀释度来进行标本核酸定量时的注意点.优点是不需要特殊设备,缺点是扩增反应条件要标准化,严格注意污染,避免假阳性的产生.
②使用 外参照物的定量PCR,以已知浓度的目的基因为模板,按一定的倍比稀释,然后做出标准曲线图,未知的标本按这标准曲线找出对应的拷贝数.荧光定量PCR通 常使用该法做标准曲线.
③使用非竞争性内参照物的定量：PCR反应条件同样,在同一试管内,用两对引物,同步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标 序列.通过比较两种序列的扩增产量可对靶序列定量.方法A、设计并合成PCR扩增靶基因及无关基因的引物,优化引物配比的条件.方法B、在指数增长期实现 对靶基因及一系列已知含量无关基因的PCR扩增.方法C、PCR产物琼脂糖凝胶电泳,EB 染色.方法D、电泳条带的紫外光下分析.方法E、二者荧光强度相等管的DNA含量亦相等.该方法只有当靶序列和内标序列以相同的量存在时,才能对两者相对 定量；也是对处于扩增指数期的PCR产物定量.
④使用竞争性内参照物的定量PCR：同样的反应条件,同一个试管,用同一对引物,同步扩增靶序列和内参照序 列.靶基因的量可通基本条件是靶序列和竞争性序列均用相同的引物以相同的效率扩增,两序列的初始化比值在整个反应过程中保持不变.目的DNA 内参照DNA 变性（同一对引物）PCR竞争性模板的设置：通过改变克隆的靶基因的序列来设计竞争性模板插入新的限制性酶切位点或使原来的酶切位点缺失通过基因重组技术 插入一个与特异性蛋白结合的DNA片段,或者使靶序列发生定点诱变人工合成竞争性模板.竞争性模板设计目的：使其与靶基因的PCR扩增产物相区别（通过酶 切、杂交、显色等手段实现）.常用的荧光定量为TaqMan探针技术,他特异的和目的片段结合,只是用的是TaqMan.半定量RT-PCR用做内参照,也应该是第三种,只是它是普通PCR,通过电泳的条带强弱,与GAPDH的比值,分析他们的灰度值半定量,个人认为数据不可靠,应该用TaqMan做相对 定量或绝对定量.用rt-pcr比较两株细胞表达量的差异的时候,不一定要把两株细胞调整为相同浓度,因为要做内参照,可以校正模板量的差异
半定量pcr内参基因扩增条件和目的基因扩增条件一样
以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本 中靶基因的拷贝数,称为定量PCR.根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增,定量PCR可分为四种：
①有限稀释法,即倍比稀释法：通过稀释阳性样品直至靶基因不能再扩增为止,来设置已知浓度的参照品；根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线,计算出待检标本中原始模 板的分子数；利用最大稀释度来进行标本核酸定量时的注意点.优点是不需要特殊设备,缺点是扩增反应条件要标准化,严格注意污染,避免假阳性的产生.
②使用 外参照物的定量PCR,以已知浓度的目的基因为模板,按一定的倍比稀释,然后做出标准曲线图,未知的标本按这标准曲线找出对应的拷贝数.荧光定量PCR通 常使用该法做标准曲线.
③使用非竞争性内参照物的定量：PCR反应条件同样,在同一试管内,用两对引物,同步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标 序列.通过比较两种序列的扩增产量可对靶序列定量.方法A、设计并合成PCR扩增靶基因及无关基因的引物,优化引物配比的条件.方法B、在指数增长期实现 对靶基因及一系列已知含量无关基因的PCR扩增.方法C、PCR产物琼脂糖凝胶电泳,EB 染色.方法D、电泳条带的紫外光下分析.方法E、二者荧光强度相等管的DNA含量亦相等.该方法只有当靶序列和内标序列以相同的量存在时,才能对两者相对 定量；也是对处于扩增指数期的PCR产物定量.
④使用竞争性内参照物的定量PCR：同样的反应条件,同一个试管,用同一对引物,同步扩增靶序列和内参照序 列.靶基因的量可通基本条件是靶序列和竞争性序列均用相同的引物以相同的效率扩增,两序列的初始化比值在整个反应过程中保持不变.目的DNA 内参照DNA 变性（同一对引物）PCR竞争性模板的设置：通过改变克隆的靶基因的序列来设计竞争性模板插入新的限制性酶切位点或使原来的酶切位点缺失通过基因重组技术 插入一个与特异性蛋白结合的DNA片段,或者使靶序列发生定点诱变人工合成竞争性模板.竞争性模板设计目的：使其与靶基因的PCR扩增产物相区别（通过酶 切、杂交、显色等手段实现）.常用的荧光定量为TaqMan探针技术,他特异的和目的片段结合,只是用的是TaqMan.半定量RT-PCR用做内参照,也应该是第三种,只是它是普通PCR,通过电泳的条带强弱,与GAPDH的比值,分析他们的灰度值半定量,个人认为数据不可靠,应该用TaqMan做相对 定量或绝对定量.用rt-pcr比较两株细胞表达量的差异的时候,不一定要把两株细胞调整为相同浓度,因为要做内参照,可以校正模板量的差异
以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本 中靶基因的拷贝数,称为定量PCR.根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增,定量PCR可分为四种：
①有限稀释法,即倍比稀释法：通过稀释阳性样品直至靶基因不能再扩增为止,来设置已知浓度的参照品；根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线,计算出待检标本中原始模 板的分子数；利用最大稀释度来进行标本核酸定量时的注意点.优点是不需要特殊设备,缺点是扩增反应条件要标准化,严格注意污染,避免假阳性的产生.
②使用 外参照物的定量PCR,以已知浓度的目的基因为模板,按一定的倍比稀释,然后做出标准曲线图,未知的标本按这标准曲线找出对应的拷贝数.荧光定量PCR通 常使用该法做标准曲线.
③使用非竞争性内参照物的定量：PCR反应条件同样,在同一试管内,用两对引物,同步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标 序列.通过比较两种序列的扩增产量可对靶序列定量.方法A、设计并合成PCR扩增靶基因及无关基因的引物,优化引物配比的条件.方法B、在指数增长期实现 对靶基因及一系列已知含量无关基因的PCR扩增.方法C、PCR产物琼脂糖凝胶电泳,EB 染色.方法D、电泳条带的紫外光下分析.方法E、二者荧光强度相等管的DNA含量亦相等.该方法只有当靶序列和内标序列以相同的量存在时,才能对两者相对 定量；也是对处于扩增指数期的PCR产物定量.
④使用竞争性内参照物的定量PCR：同样的反应条件,同一个试管,用同一对引物,同步扩增靶序列和内参照序 列.靶基因的量可通基本条件是靶序列和竞争性序列均用相同的引物以相同的效率扩增,两序列的初始化比值在整个反应过程中保持不变.目的DNA 内参照DNA 变性（同一对引物）PCR竞争性模板的设置：通过改变克隆的靶基因的序列来设计竞争性模板插入新的限制性酶切位点或使原来的酶切位点缺失通过基因重组技术 插入一个与特异性蛋白结合的DNA片段,或者使靶序列发生定点诱变人工合成竞争性模板.竞争性模板设计目的：使其与靶基因的PCR扩增产物相区别（通过酶 切、杂交、显色等手段实现）.常用的荧光定量为TaqMan探针技术,他特异的和目的片段结合,只是用的是TaqMan.半定量RT-PCR用做内参照,也应该是第三种,只是它是普通PCR,通过电泳的条带强弱,与GAPDH的比值,分析他们的灰度值半定量,个人认为数据不可靠,应该用TaqMan做相对 定量或绝对定量.用rt-pcr比较两株细胞表达量的差异的时候,不一定要把两株细胞调整为相同浓度,因为要做内参照,可以校正模板量的差异
家庞力度： 半定量pcr内参基因扩增条件和目的基因扩增条件一样 以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本 中靶基因的拷贝数,称为定量PCR.根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增,...
浔阳区13112777183： PCR 内参 跑胶 - ？
家庞力度： 如果按理论算的话,电泳条带亮度的不同代表起始浓度的不同,但是,你要知道,DNA模板浓度达到一定程度之后,PCR产物亮度和起始模板浓度并不是完全成正比的.如10^7次方的模板和10^8次方的模板PCR的产物电泳亮度可能区别就不是很大,也就是扩增效率会随着模板浓度的变化而变化.所以我们要尽量使内参的条带亮度一致,以保证模板浓度一致,这样就尽量可以使各个不同模板之间在扩增目的基因时的扩增效率一致.
浔阳区13112777183： 怎样验证目的基因和内参基因的扩增效率一致 - ？
家庞力度： 怎样验证目的基因和内参基因的扩增效率一致 相对定量有两种方法.要求扩增效率相同的是ΔΔCt法,因为只有扩增效率相同目的基因与内参基因的Ct值之差才是恒定的值,这是使用这种方法处理数据的前提,所以正式实验之前要进行条件优化,这种方法的优势是不用作标准曲线.如果扩增效率不同就要用另一种双标准曲线法,这种方法需要标准品,稀释不同的浓度梯度,作标准曲线,根据标准曲线得到你的拷贝数在进行数据处理,得到相对值.
浔阳区13112777183： 目的基因的检测 - ？
家庞力度： 可以有很多种方法的~ 可以像楼上所说的DNA杂交技术~ 还可以用蛋白质检验~例如大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因,当这种质粒成为重组质粒并被转入受体细胞后,可根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得目的基因 还可以运用RNA杂交技术检验~具体过程像DNA杂交技术~不过是换成RNA~ 还可以用抗原-抗体技术检验~例如转基因抗虫稻米~想知道目的基因是否起作用~捉些虫子进去~看看虫子会不会吃~不会吃就说明目的基因成功导入了~方法应该还有很多~我所学的就是这些~希望对你有用~
浔阳区13112777183： 如何检测细胞基因的内源性 表达 - ？
家庞力度： 如何检测细胞基因的内源性 表达 首先要确认目的基因已经传入受体细胞.然后再检测其表达情况,一般有两种方法:一个是通过特定性状来判断目的基因是否表达,比如导入的目的基因是编码某种酶的,那么最简便有效的方法就是经过表达后检测有没有相应酶的活力,同时跑蛋白胶,看有没有预期的目的条带,因为对于酶来说,有时候目的基因虽然表达了,但是酶没有活力,这时就不是表达的问题了.另外一个就是利用抗原-抗体特异性结合原理,检测目的基因是否翻译成蛋白.
浔阳区13112777183： 相对定量 标准曲线法 弄不明白 求助高手 - ？
家庞力度： 目前real time PCR做定量主要由两种方法,一种是标准曲线法,即目的基因和内参都需要做标曲;另外一种是这种办法的升级版或者简便版,即双△CT法,不用做标曲直接跑待测样品就行.
浔阳区13112777183： 如何验证目的基因和内参基因的扩增效率一致 - ？
家庞力度： 如何验证目的基因和内参基因的扩增效率一致 内参基因和待测基因本来就不一样.扩增曲线和溶解曲线不是一个概念.扩增曲线是每扩增一个循环,测量一次荧光强度.这个由底物的浓度和扩增效率所决定.目的基因和内参的浓度肯定不同,而且引物的序列不同,扩增效率也可能不一样,所以两者的曲线肯定有可能不一样.SyberGreen PCR,溶解曲线是PCR完成以后,对产物逐步加温,测量荧光强度的变化,而不是荧光强度本身.DNA双链在温度达到TM附近时,发生大量的解离,荧光强度的变化最大,出现峰值.这个峰值的位置是由PCR产物的TM值所决定的,和PCR产物的序列,GC比例有关.所以内参基因和目的基因的峰值肯定是不一样的.
浔阳区13112777183： 做RT - PCR内参的作用是什么?应该如何选择管家基因啊?？
家庞力度： 内参的选择:普通PCR内参的大小没有多大要求,但real time一般选择300bp以下 它的作用在于你提取的RNA逆转录成cDNA时,加入的浓度可能会不一致,即使用分光广度计测其浓度,也会有仪器误差.PCR时,每个标本都要做对应的内参,...
浔阳区13112777183： 目的基因的检测与鉴定 - ？
家庞力度： 有很多方法可以检测,最简单的就是western blot.外源转染或经诱导后基因表达,利用抗目的蛋白的抗体进行杂交,荧光检测或化学发光检测显影结果.
浔阳区13112777183： 通过什么技术可以检测外援基因 - ？
家庞力度： 跑电泳,与原来的基因序列做对比,如果变长了,就是插入外源基因了,插入太短是看不出来的;测序,去Blast一下,看看测序结果上有没有其他生物源的基因.还有就是,一般有外源基因的宿主,一般都有一段特殊的基因片段,可以用PCR的方法把这段序列拉出来,看看有没有这段序列......
