RT-PCR 结果，请教问题可能出在哪一部分。谢谢
作者&投稿：致田 （若有异议请与网页底部的电邮联系）
为什么要编？难道想害人吗？检测结果是客观的，来不了半点造假？希望能端正态度！！
我之前也用 通用引物扩增 鳜鱼的mt DNA。你可以用别人的样品扩增 试一试。你的问题首先不打明确，后来自己从新设计引物、作为前辈 我告诉你。如需帮助请留言，文献写的扩的出来，所谓通用引物的定义你好好看看就明白了、甚至没有。这个很正常。建议你重新设计特异性引物，看你扩增的效果是不是和别人一样 也是7-10个带如果和别人一样哈哈 你这是问对人了、说明通用引物对于你的样品（物种） 扩增多态性不好即3-4，我怎么弄就是出不来
你提取的四个RNA中，除了2号浓度很低之外，另外三个肯定符合做RT-PCR的要求了，CDNA也是，浓度是够的。而电泳图中PCR产物的1234都是引物二聚体，没有出现你的目的基因
所以我的判断是：问题出在PCR这一过程。有可能是引物设计有问题，也有可能是退火温度不合适，或者PCR时间不合适。鉴于你的扩增片段长度都在500以下，
我建议的程序：
94度3分钟，一个循环；
94度20秒，退火（几度就看你引物的Tm值减去3～5度）30秒，72度延伸30秒，循环35次；
72度延伸5分钟。
另外，我想问一下，你的GAPDH这对引物是第一次做还是之前一直在做？因为GAPDH做不出来的话实验体系肯定是有问题的。
如果之前实验室有在用的话，现在做不出来就是试剂的原因了；如果GAPDH引物是第一次做的话，先去验证引物是否真确，另外就是优化PCR扩增条件和试剂组分了。
贰娴羧甲： 你提取的四个RNA中,除了2号浓度很低之外,另外三个肯定符合做RT-PCR的要求了,CDNA也是,浓度是够的. 而电泳图中PCR产物的1234都是引物二聚体,没有出现你的目的基因 所以我的判断是:问题出在PCR这一过程.有可能是引物设...
兰州市18214924437： rt - pcr产物做测序结果有双峰,这个结果就完全不能用了吗? ？
贰娴羧甲： 要看你出现的双峰是个别碱基还是所有碱基,如果是个别碱基,那么也有可能是基因多态性,可能还有重大发现呢.如果是测序结果开始没有问题,后面出现问题,有可能是测序本身的问题,再试试看.如果所有位置都有双峰,那问题比较倾向于实验本身的问题,还要看你实验目的是什么:如果RT-PCR结果是用来分析基因的表达,那么两种不同片段都被计算在表达量上了,因此就彻底没有什么用了,重新开始吧.如果你是想克隆一个基因或者一个基因片段,那么没有关系,把RT-PCR扩增的片断纯化后装到任何一个载体里面,转化大肠杆菌,获得阳性克隆.按照概率,其中一部分应该是你需要的目的基因,酶切后进行测序鉴定,找出你需要的克隆就可以了.
兰州市18214924437： RT - PCR做不出来 - ？
贰娴羧甲： 建议你先找一现成的DNA模板及相应的引物,然后做PCR,如果做出来了说明PCR体系没有问题.那问题就可能是出在反转录上了,RNA提取好之后可以跑个电泳或者检测OD值,以确认RNA提取是否成功.另外,检查是否用错反转录引物?针对不同的RNA样本类型要使用不用的反转录引物,病毒细菌之类的用随机引物作反转录引物,动植物RNA用OligodT(我们实验室用17个T的引物)作为反转录引物.
兰州市18214924437： RT - PCR中总出现弥散条带,又不是退火温度问题,怎么办? - ？
贰娴羧甲： 我以前做实验也碰到过这样的情况,结果原因是引物过期了,加水稀释好的引物过了一年后再使用就可能出现条带弥散的情况,有没有可能是你的引物合成时间太久了降解了?
兰州市18214924437： pcr产物跑琼脂糖胶都是整条泳道亮,求如果改变pcr的条件可以pcr出单一条带 - ？
贰娴羧甲：[答案] 1、整条道都亮可能是因为你弥散了,属于没有P出足够的特异条带? 2、当然如果你是RT-PCR就有可能是降解了··· 3、也可能是跑出去了,所以,缩短时间(看溴酚蓝跑到哪里了?) 4、你做了PCR前跑胶了么?你确定有P前有东西? 5、引物...
兰州市18214924437： RT - PCR实验中为什么只出现一条引物的带 - ？
贰娴羧甲： 说明没扩出来呗 建议 1.增加actin等参照管做对照.actin表达比较保守且表达量高,均可以扩出来.如果扩不出来说明你RNA有问题,重新抽提 2.如果参照没问题,和你的引物分别一起扩,配一样的体系,如果你的引物还扩不出来,换用好点的酶试下 3.如果还出不来,重新设计引物吧
兰州市18214924437： 我还想请教一下哦,就是我的RTPCR,为什么不同的反转录的模板跑PCR,实验组和对照组的趋势每次会不同? - ？
贰娴羧甲： 同一模板是技术重复,看来不应该是仪器问题,而生物学重复性不好,这是RT常见问题,尤其是RT-qPCR,涉及的环节很多,需要逐步检查和设置对照; 样品处理控制,如细胞培养的处理组和对照组是否严谨; 细胞计数是否准确; 考虑好是一步法RT-PCR还是两步法;RNA提取(最可能出问题的),是否污染、及时、降解;RNA降解很快,很容易受到RNASE污染,务必注意; RNA提取后,每次做电泳和紫外,比较重复性是否好; pcr时,设置内参、阳性、阴性对照,做好标准曲线.个人见解,目前想到的就这么多,欢迎继续讨论,祝实验顺利!
兰州市18214924437： RT - PCR融解曲线详解 - ？
贰娴羧甲： 融解曲线是荧光定量PCR仪出现后为了考察染料法结果的特异性产生的.大家使用荧光定量PCR的目的(也是荧光定量PCR的宣称优点)有快速、准确及无污染,其中快速的前提之一是不用跑电泳就可以通过扩增曲线考察初始拷贝数的量;准...
兰州市18214924437： RT PCR只跑出内参的条带,没有目的基因,原因有哪些? - ？
贰娴羧甲： 我也遇到过这种问题,个人觉得可能是目的基因的定量引物不好,还有就是要优化PCR条件!
兰州市18214924437： RT PCR实验 结果出现非特异性扩增 图像如果显示?它的原因和图像出现拖尾的原因一样吗? - ？
贰娴羧甲： 当然是非特异性条带或拖尾. 主要原因是引物的特异不好或扩增条件不好. 需重新设计特异性更强的引物和优化PCR扩增条件.
