构建cDNA文库是否需要酶切
反转录酶:以mRNA为模板反转录合成DNA。
限制性内切酶:酶切目的基因和载体,使其产生相同的粘性末端。
DNA连接酶:连接目的基因和载体。
可以,影响很小。
必须要酶切,切割的是质粒!夜深了,手机打字也慢,明天中午,我再给你补充详细解释吧。——————
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是的,基因组文库需要酶切,cDNA文库不需要酶切,但这指的是目的基因。不管哪一种,目的基因要想与质粒连接,都是需要酶切的,因为必须把质粒切开,才能连接目的基因。
基因组文库,是直接从染色体DNA分子上获取目的基因,肯定需要限制酶进行特异性切割。
cDNA文库构建,是用细胞内总的mRNA进行反转录,每个mRNA上只有一个基因,并且不含有内含子(这也是cDNA文库的优点所在)。反转录获得的cDNA不需要酶切(因为只含有一个基因),两端适当处理,即可与切开的质粒DNA连接,再进行转化即可。cDNA不能切,切了就没用了。一般,一个细胞内有上千种mRNA,所以反转录得到的cDNA也是上千种,都不一样,但每个只含有一个基因,cDNA是比较短的。一个cDNA就可以转化一个受体菌,形成一个菌落,这个菌落就只含有这种cDNA了。
具体,可以百度一下“cDNA文库”,百科里介绍的有。大学王镜岩《生物化学》教材里介绍的也有。
构建cDNA文库不需要酶切成随机的短片段,因为cDNA长度不大,可以克隆到像质粒那样的载体上。
mRNA逆转录成cDNA,需要加上adaptor,然后用PCR扩增该文库,这样的文库已经可以使用。但为了方便使用,adaptor上设计了的酶切位点,可非常方便地将cDNA克隆到载体上做成表达文库。
mRNA是一个很大的群体,所以得到的cDNA也是一个大群体,而且一个mRNA对应一个cDNA。另外,逆转录后是单链的DNA,PCR后才是双链的。
构建cdna文库时,如何保证双链cdna与表达载体以正确的方向连接?
构建cDNA文库时,需要将双链cDNA与表达载体连接起来,以便将目标基因表达出来。为了保证双链cDNA与表达载体以正确的方向连接,可以采取以下措施:选择合适的限制性内切酶:在连接双链cDNA和表达载体时,需要使用限制性内切酶进行切割。选择合适的限制性内切酶可以保证连接的方向正确。选择合适的连接方式:连接双链...
cDNA文库必须满足什么条件?其构建包括哪些步骤?
条件:1 、要使用mRNA经过反转录PCR产生cDNA.2 、要进一步获得cDNA全长3 、加适当接头,连接到适当的载体内.4 、转化受体细胞,构建为cDNA文库.基本步骤包括:RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法...
组建cDNA文库的组建有哪些步骤?
将提取的总RNA在寡聚脱氧核苷酸[oligo(dT)]纤维素中进行亲和层析,分离获得mRNA。(2)cDNA第一链的合成:所有cDNA第一链的合成方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应。与cDNA第一链合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3′端poly(A)互补的1218个核苷酸长的oligo(dT),沿模板...
为何要建立CDNA文库而不是DNA文库
这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难.高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多.参考资料:百度百科 ...
在什么情况下需要构建cDNA?
连接效率高低直接关系到文库构建是否成功,更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。一般的片段克隆连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接,而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的目的DNA连接,目的基因cDNA长的有10kb以上,短的只有500bp或更短。一系列长度不等的cDNA与载体在一起连接...
如何鉴定cDNA文库是否构建成功?通常都是用什么方法鉴定的?
1 直接筛选: 1 利用抗性基因标记 2 营养标记 3 阿拉法半乳糖苷酶标记(插入突变)2 菌落原位杂交杂交(质粒文库)\/噬菌斑原位杂交(噬菌体文库),然后用southern杂交检测阳性的位点 3 对于表达文库的鉴定,可以通过1表形分析,2利用免疫学探针,3 产物生物功能来判断 ...
何谓cDNA基因文库?利用cDNA基因文库钓取目的基因有何优越性?
【答案】:cDNA基因文库是指在逆转录酶作用下,以mRNA为模板形成它的互补DNA(complementary DNA,简称cDNA)单链,然后进一步形成双链DNA。将这种双链DNA同适宜的载体(例如质粒)连接成为重组DNA。导入受体细胞(例如细菌)并进行克隆,就成为cDNA基因文库。由于构建cDNA基因文库时,采用的是总mRNA,所以该基因...
如何构建CDNA文库?
cDNA文库的构建分为六个阶段:阶段1:反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2:cDNA第二链的合成 阶段3:cDNA的甲基化 阶段4:接头或衔接子的连接 阶段5:Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA 阶段6:cDNA与λ噬菌体臂的连接
cDNA文库的构建一般分为哪四步?
【答案】:cDNA文库的构建一般分为以下四步:(1)细胞总RNA的提取和mRNA的分离;(2)cDNA第一条链的合成;(3)cDNA第二条链的合成;(4)双链DNA克隆进质粒或噬菌体载体,并导入宿主中繁殖。
何谓基因文库?何谓cDNA文库,有何优点?建库对于分离目的基因有何重要作...
【答案】:基因文库是指包含某一生物基因组DNA片段的全部克隆。即将整个基因组DNA切成片段,并用合适的载体将全部DNA片段进行克隆。文库中每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。cDNA文库是指包含某一生物mRNA的全部cDNA克隆。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。cDNA文库的优点:①文库中只含...
程任幼泻: 需要表达和研究表达的mRNA时
海沧区18293864063: 构建cDNA文库时都要用限制性内切酶么?用的限制性内切酶都一样吗 - ?
程任幼泻: 要用各种各样的内切酶,达到最大程度上覆盖整个基因库
海沧区18293864063: 什么是cDNA文库?它和基因文库的差别有哪些 - ?
程任幼泻: cDNA文库: 以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细...
海沧区18293864063: 构建基因组文库时为什么要进行酶切 - ?
程任幼泻: 构建基因组文库,必须在基因组DNA两端制造合适的粘性末端(而酶切是制造匹配粘性末端常用的方法),再与相应载体连接,转化相应菌株,然后筛选.
海沧区18293864063: 构建CDNA文库所需的酶有几种?是那些?谢谢(高中生)说的通俗点~ - ?
程任幼泻: 反转录酶:以mRNA为模板反转录合成DNA. 限制性内切酶:酶切目的基因和载体,使其产生相同的粘性末端. DNA连接酶:连接目的基因和载体.
海沧区18293864063: 构建CDNA文库所需的酶有几种?是那些?谢谢(高中生)说的通俗点~ - ?
程任幼泻:[答案] 反转录酶:以mRNA为模板反转录合成DNA. 限制性内切酶:酶切目的基因和载体,使其产生相同的粘性末端. DNA连接酶:连接目的基因和载体.
海沧区18293864063: cDNA文库必须满足什么条件?其构建包括哪些步骤? - ?
程任幼泻: 条件:1 、要使用mRNA经过反转录PCR产生cDNA.2 、要进一步获得cDNA全长3 、加适当接头,连接到适当的载体内.4 、转化受体细胞,构建为cDNA文库. 基本步骤包括:RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚...
海沧区18293864063: 从基因组文库中获取的目的基因是否需要限制酶? - ?
程任幼泻: 如果文库已经构建好了就不需要限制酶了,直接用引物扩增就可以;当然,如果想再将该基因导入受体细胞的过程中需要构建表达载体,这就需要限制酶了.
海沧区18293864063: 高三生物 从基因文库中提取基因需要限制酶吗? - ?
程任幼泻: 现在的生物已经这么难了吗……o(╯□╰)o 这道题 的A肯定是对的.选项B有争议.是这样的,一般从文库中调取基因,不会直接用限制酶酶切,而是首先需要pcr扩增,而后连接到所需的载体上.当然,如果酶切位点合适,质粒又充足,直接酶切调取也是可以的(几率非常小).其次,真核生物的基因都有外显子和内含子,一般需要将内含子去除.而基因文库也不知道是DNA文库还是cDNA文库,如果是cDNA文库,就可以直接进行调取,不然就要先提取mRNA然后反转录得到cDNA,保证是没有内含子的基因序列,才能表达.
海沧区18293864063: 基因组文库+CDNA文库=基因文库吗? - ?
程任幼泻: 基因文库:一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后,将酶切片段插入到载体DNA分子中,所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体,将包含这个生物体的整个基因组,也就是构成了这个生物体的基因文库 cDNA文库:以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库 基因组文库:是包含所有基因组序列即不论基因还是非基因序列都有的文库 基因组文库+CDNA文库=基因文库是不对的