蛋白纯化——His标签与GST标签
His-Tag（组氨酸标签）
His-Tag（组氨酸标签）His-Tag 由6-10 个组氨酸残基组成，分子量不到0.84KD，通常插入在目的蛋白的C 末端或N 末端。His-Tag是目前原核表达最常用的标签，蛋白纯化完之后可以不需切除此标签，也不会对蛋白产生功能影响。同时，蛋白纯化步骤简便，纯化条件温和，对蛋白也不会产生太大影响。His-Tag是蛋白纯化的首选标签。
His-Tag 的特点
His-Tag 本身的特性对目的蛋白没有影响，不会形成二聚体；
分子量较小，只有0.84KD，对蛋白的下游应用不会产生影响；
免疫原性低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备 抗体 ；
His-Tag 与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；
可与其他标签构建双标签表达，可用于多种蛋白表达系统，纯化条件温和对蛋白影响较小。
磁珠法纯化His-Tag蛋白的原理
海狸His-tag蛋白纯化磁珠以磁性 琼脂 糖微球为基质，活化偶联亚氨基二乙酸（IDA）,分别螯合镍离子（Nickel）、钴离子（Cobalt）两种金属离子，组氨酸残基侧链与金属离子（镍/钴离子）有强烈吸引力，可通过磁性分离方式直接从生物样品中一步纯化出高纯度的目标蛋白，海狸His-Tag蛋白纯化磁珠纯化后的蛋白纯度高于85%。
GST-Tag（谷胱甘肽巯基 转移酶 标签）
GST-Tag（谷胱甘肽巯基转移酶标签）GST-Tag 相对分子质量较大，约为26KD，插入在目的蛋白的C 末端或N 末端，大肠杆菌中常用在N 端。GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶。一般选择GST 标签的目的有两个，一是提高蛋白表达的可溶性，二是提高蛋白的表达量。蛋白表达纯化结束后需根据不同的蛋白应用而确定是否切除标签，标签较大，切除与否需根据下游应用考虑。如果要去除GST 融合部分，可用位点特异性 蛋白酶 切除。检测方法可用GST 抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。
GST-Tag 的特点
增加外源蛋白的可溶性；可在不同的宿主中表达，适用范围广；
可用不同的蛋白酶方便去除；
很好保留了蛋白的 抗原 性和生物活性，提高外原蛋白的稳定性；
高特异性，纯化方便且温和；
分子量较大，可能会影响 蛋白质 的功能和下游实验；
如果蛋白不可溶，很难用变性的方法纯化。
磁珠法纯化GST-Tag蛋白的原理
海狸GST融合蛋白纯化磁珠，通过磁珠偶联谷胱甘肽(GSH)，利用谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶之间酶和底物的特异性作用力，分离出带有GST标签的蛋白，纯化蛋白的纯度达到90%。
用Ni亲和层析柱纯化His标签融合蛋白时需要注意哪些事项
不是绝对的，两种方法其实都差不多。但是柱切和洗脱后酶切还是有不同的。柱切比较方便，酶切之后直接收流穿的部分就是目的蛋白。缺点是在洗脱之前不知道蛋白产量，可能努力了半天什么都没有，而且有些蛋白不稳定，可能在柱切过程中沉淀在柱子上了。洗脱后再切，比较直观的检测初步富集的蛋白量，再决定...
用镍柱纯化带his标签的蛋白,蛋白过镍柱时忘记加wash buffer就加elute bu...
buffer清洗镍柱，就直接用elute buffer洗脱了么。这样的话洗脱效果会比较差一些，洗脱的蛋白纯度会明显降低。虽然his标签的蛋白结合镍柱时特异性非常高，但因为种种原因总会有一些杂蛋白非特异性吸附在柱子上，所以要先用wash buffer冲洗掉这部分杂蛋白，再用elute buffer洗脱，已达到最好的纯化效果。
MBP标签的融合蛋白纯化原理
麦芽糖结合蛋白与亲和填料结合了，当存在高浓度的麦芽糖的时候，麦芽糖会和麦芽糖结合蛋白相互竞争亲和填料，麦芽糖结合蛋白肯定竞争不过，就被洗脱下来了。
用Ni亲和层析柱纯化His标签融合蛋白时需要注意哪些事项?
使用Ni柱纯化带有His标签的融合蛋白，是我们大家再熟悉不过的实验操作了。我们对整个操作的流程及注意事项，很可能是师从兄师姐那里获得的。这 些经验都是大家智慧的结晶。同时，这也有一定的不足之处，那就是我们学习到的是局部，还有一些我们不常用或者基本不会接触到的面儿，那些知识我们应该从哪 里...
前后两端都有his标签会影响纯化吗
不会。亲和层析树脂可以特异地结合HIS标签蛋白，前后两端都有his标签而其它杂质不受影响，不会影响纯化。
我蛋白的等电点是9.3那么his镍柱蛋白纯化buffer的ph怎样确定
pH7.4时镍柱对His标签亲和力最强，但是为了保证蛋白不沉淀，pH应偏离等电点1左右。由于你的蛋白等电点在9.3，所以建议可以用7.4到8之间试一下。
有哪位高手用过novagen的his-Binding蛋白纯化试剂盒
有哪位高手用过novagen的his-Binding蛋白纯化试剂盒 1. 前处理 把蛋白质从原来的组织或溶解状态释放出来，保持原来的天然状态，并不丢 失生物活性。常用的方法：匀浆器破碎、超生波破碎、纤维素酶处理以及溶菌酶等。超声波破碎法：当声波达到一定频率时，使液体产生空穴效应使细胞破碎的技术。超声波引起的...
最近拿镍柱做实验,可纯化不到His-tag融合蛋白,求高手指点原因
首先找一种正常的标签蛋白进行一下纯化试验，如果能够纯化出来那就是你的蛋白的问题，可能是蛋白在表达的时候非正常折叠，标签被折叠在内部，没有在蛋白表面游离着，这样的话当然不会被镍柱捕获了。比较严重的情况就是包涵体的形成，是否形成包涵体你可以根据蛋白的性质反应或者是电泳检测一下离心后的细胞...
Ni-NTA纯化His标签蛋白的洗脱方法有哪些
Ni-NTA纯化His标签蛋白的洗脱方法 结合缓冲液：20mM磷酸纳，0.25M NaCl，10mM咪唑，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM磷酸纳，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4
His-taq纯化蛋白不挂柱子,可能的问题是什么?求高人指点。
如果柱子白了，就是需要再生充镍了。如果还是蓝的，可能吸附了太多杂蛋白，需要彻底洗一洗；也可能蛋白样品有问题，浓度、pH、离子等等。
边柳孚贝： his标签蛋白就是:六个组氨酸.一般存在于重组蛋白氮端或碳端,便于纯化该重组蛋白,组氨酸可以特异性的结合镍离子,带有组氨酸标签的重组蛋白可以被镍柱吸附,从而达到纯化的目的.也就是在表达载体上面,特别加六个组氨酸的碱基序列,目的就是纯化.…………………… ……………………………… 更多具体材料请参考: 蛋白表达 http://product.bio1000.com/100182/
丹寨县18067543336： 6*his标签结合蛋白分离纯化时用不用切掉 - ？
边柳孚贝： 分离纯化时是否需要切除his标签要看标签是否会影响到蛋白的活性.一般情况下6xhis是一个非常小的标签,不会对蛋白整体的结构和活性有太大影响,如果是加了Trx的His标签可能会需要切除掉.
丹寨县18067543336： GST纯化蛋白 - ？
边柳孚贝： GST标签太大了,HIS小,但是估计没GST好纯化,我用的是HIS标签,结果,总有两个杂蛋白去不掉,挺郁闷,上AKATA效果也不怎么好如果多个大个的GST不影响你蛋白活性的话,那GST吧.
丹寨县18067543336： 怎么纯化蛋白 - ？
边柳孚贝： 蛋白纯化方法很多,也很复杂,一般程序如下:分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步.前处理 分离纯化某种蛋白质,首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态...
丹寨县18067543336： 纯化蛋白是否必须添加组氨酸标签 - ？
边柳孚贝： 不一定必须加组氨酸标签! 你也可以加其他标签, 比如:GST 等.也可以不加标签,不过要清楚蛋白的性质,比如等电点, 根据等电点就可以用离子交换柱进行纯化!
丹寨县18067543336： 6his标签重组蛋白纯化成功要注意什么 - ？
边柳孚贝： 组氨酸标签蛋白的纯化 His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式,而且很成熟,它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性,无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去(IMAC)纯化. 2.1 IMAC(Immobilized Metal-io
丹寨县18067543336： his标签蛋白是什么 - ？
边柳孚贝：[答案] 是这样的,his标签蛋白就是:六个组氨酸.一般存在于重组蛋白前面或后面,便于纯化该重组蛋白,组氨酸可以特异性的结合镍离子,带有组氨酸标签的重组蛋白可以被镍柱吸附,从而达到纯化的目的.也就是在表达载体上面,特别加六个组氨酸的碱...
丹寨县18067543336： GST标签蛋白的纯化,目的蛋白在GST标签切除后的浓缩、纯化(离子交换和分子筛)过程中出现了聚集和降解. - ？
边柳孚贝： gst-tag切除后直接过一个gst柱,tag就挂柱上了,目标蛋白就在穿透里了.如果带着标签纯化的话,过离子柱不是还要摸索条件吗,而且分子筛的纯化量很低.建议先过gst柱,然后柱上酶切掉标签,这样穿透里就会是目标蛋白,也不容易发生聚集啥的
丹寨县18067543336： western blot tag怎么选做western blot中tag有哪些,怎么选择啊 - ？
边柳孚贝：[答案] 一般都用His tag, GST tag, flag tag. myc tag 看你手里的标签载体都有什么了,当然也要看你的实验目的 通常真核表达我们选择 flag tag. myc tag,IP实验会用这两个标签; 原核表达选择His tag, GST tag多一些,因为这两个tag便于蛋白纯化.
