叶绿体色素提取,分离及理化性质的鉴定实验报告

叶绿体中色素的提取和分离~

绿叶中色素的提取和分离

视频就没有。报告就有。。

实验 8 叶绿体色素的定量测定
一、原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯–比尔定律，某有色溶液的消光度 D 与其中溶质浓度 C 和液层厚度 L 成正比，即：
D = kCL （ 17 – 1 ）

式中： k 为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1cm 时， k 为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下消光度的总和，这就是消光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a 、 b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在 3 个特定波长下的消光度 D ，并根据叶绿素 a 、 b 及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素 a 、 b 时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素 a 、 b 的 80 ％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为 663nm 和 645nm ，又知在波长 663nm 下，叶绿素 a 、 b 在该溶液中的比吸收系数分别为 82.04 和 9.27 ，在波长 645nm 下分别为 16.75 和 45.60 ，可根据加和性原则列出以下关系式：

D 663 = 82.04C a +9.27C b （ 17- – 2 ）
D 645 = 16.75C a +45.60C b （ 17 – 3 ）

式中： D 663 、 D 645 ——叶绿素溶液在波长 663nm 和 645nm 时的消光度；
C a 、 C b ——叶绿素 a 和 b 的浓度， mg/L 。
解方程组 17 – 2 、 17 – 3 得：

C a = 12.72D 663 – 2.59D 645 （ 17 – 4 ）
C b = 22.88D 645 – 4.67D 663 （ 17 – 5 ）

将 C a 与 C b 相加即得叶绿素总量 C T ：

C T = C a +C b =20.29D 645 + 8.05D 663 （ 17 – 6 ）

另外，由于叶绿素 a 、 b 在 652mn 的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为 34.5 ），也可以在此波长下测定一次消光度（ D 652 ）而求出叶绿素 a 、 b 总量：
C T = （ D 652 × 1000 ）／ 34.5 （ 17 – 7 ）
在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法也可以同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。 Lichtenthaler 等对 Arnon 法进行了修正，提出了 80 ％丙酮提取液中 3 种色素含量的计算公式：
C a = 12.21D 663 – 2.81D 646 （ 17 – 8 ）
C b = 20.13D 646 – 5.03D 663 （ 17 – 9 ）
C x = （ 1000D 470 – 3.27C a – 104C b ）／ 229 （ 17 – 10 ）

式中： C a 、 C b ——叶绿素 a 和 b 的浓度。
C x ——类胡萝卜素的总浓度。
D 663 、 D 646 和 D 470 ——叶绿体色素提取液在波长 663 nm 、 646 nm 和 470 nm 下的消光度。
由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素 a 、 b 在 95 ％乙醇中最大吸收峰的波长分别为 665nm 和 649nm ，类胡萝卜素为 470nm ，可据此列出以下关系式：

C a = 13.95D 665 – 6.88D 649 （ 17 – 11 ）
C b = 24.96D 649 – 7.32D 665 （ 17 – 12 ）
C x = （ 1000D 470 – 2.05C a – 114C b ） /245 （ 17 – 13 ）
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
新鲜植物叶片（或其他绿色组织）。
（二）试剂
• 95 ％乙醇（或 80 ％丙酮）。
• 石英砂。
• 碳酸钙粉。
（三）仪器设备
分光光度计，研钵 1 套，剪刀 1 把，玻棒， 25 mL 棕色容量瓶 3 个，小漏斗 3 个，直径 7 cm 定量滤纸，吸水纸，擦镜纸，滴管，电子天平（ 0.01 g 感量）。
三、实验步骤
1. 取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2. 称取剪碎的新鲜样品 0.3 g ，共 3 份，分别放入研钵中，加入少量石英砂和碳酸钙粉及 2 ～ 3 mL95% 乙醇（或 80% 丙酮）研成匀浆，再加乙醇 10 mL ，继续研磨至组织变白，静止 3 ～ 5 min 。
3. 取滤纸 1 张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到 25mL 棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至 25 mL ，摇匀。
5. 把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以 95 ％乙醇为空白，在波长 665 、 649 和 470 nm 下测定消光度。
6. 按公式 17 – 11 、 17 – 12 、 17 – 13 （如用 80 ％丙酮，则按公式 17 – 8 、 17 – 9 、 17 – 10 ）分别计算叶绿素 a 、 b 和类胡萝卜素的浓度（ mg/L ）， 17 – 11 、 17 – 12 式相加即得叶绿素总浓度。
四、结果计算
求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量（用每克鲜重或干重所含叶绿体色素的毫克数表示）：
（ mg/g ）
[ 注意事项 ]
1. 为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。
2. 叶绿体色素提取液不能浑浊。可在 710 或 750 nm 波长下测量消光度，其值应小于当波长为叶绿素 a 吸收峰时消光度值的 5 ％，否则应重新过滤。
3. 用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差 l nm ，则叶绿素 a 的测定误差为 2 ％，叶绿素 b 为 19 ％，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素 a 和 b 来校正。
4. 在使用低档型号分光光度计（如： 72 、 125 、 721 型等）测定叶绿素 a 、 b 含量时，因仪器的狭缝较宽，分光性能差，单色光的纯度低（± 5 ～ 7 nm ），与高中档仪器如岛津 UV-120 、 UV-240 等测定结果相比，叶绿素 a 的测定值偏低，叶绿素 b 值偏高， a ／ b 比值严重偏小。因此，使用时必须用高档分光光度计对低档的分光光度计进行校正。
[ 思考题 ]
1 ．叶绿素 a 、 b 在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素 a 、 b 的定量分析 ? 为什么 ?
2 ．为什么提取叶绿素时干材料一定要用 80 ％的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？

【附注】 叶绿体色素简便提取方法
采用上述研磨方法提取叶绿体色素，既费工费时，又容易出现误差。为此，可采用乙醇–丙酮混合液浸泡法。其方法是，将待测叶片剪碎，装入具塞刻度试管中，加入乙醇–丙酮混合液（ 1 ∶ l ， v ／ v ） 10 mL ，使叶片完全浸入液体之中，加盖。放置于暗处，如能置于 30 ～ 40 ℃温箱中更好。当叶片完全变白时即可比色。此法简便易行，重现性好，尤其适用于大量样品的测定。最好是在浸泡过程中轻轻摇动几次。

实验三 叶绿体色素的提取分离与理化性质鉴定
一、实验目的
1、学会叶绿体色素提取和分离的方法。
2、了解叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。
二、实验原理
叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。
提取液可用色层分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。
叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
三、实验器材
新鲜的植物叶片。
研钵；漏斗；100ml三角瓶；玻璃棒；剪刀；滴管；培养皿；定性滤纸条（5cm×1.5cm）。
毛细管；试管；试管架；石棉网；烧杯（100ml）；酒精灯；铁三角架；刻度吸量管2ml、5ml各1支。
四、实验试剂
1、95%乙醇；石英砂；碳酸钙粉
2、推动剂：按石油醚：丙酮：苯（10：2：1）比例配制（体积比）
3、醋酸铜粉末；5%的稀盐酸
4、甲醇、KOH
五、实验步骤
1．叶绿体色素的提取
（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4~5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。
（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2~3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%乙醇，暗处放置3~5min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。
2. 叶绿体色素的分离
（1）取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将它剪成长约10cm ，宽约1cm的滤纸条。
（2）用毛细管吸取色素提取液。在滤纸条的一端（约距这一端的1cm处）划出一条滤液细线，等滤液干燥后，再重复划4～5次。
（3）将滤纸条的另一端（约距这一端1cm处）折成“V”字形，并将它挂在放有层析液的烧杯壁上（注意：色素线要略高于层析液面，且滤纸条下端最好不要碰到烧杯壁），盖上培养皿。
3.叶绿体色素的性质鉴定
(1)荧光现象的观察
取1支20ml刻度试管加入5ml叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同？解释原因。
(2)皂化作用（绿色素与黄色素的分离）
在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。片刻后，加入5ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1～1.5ml蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（以及少量的叶黄素）；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。
(3)H+和Cu++对叶绿素分子中Mg++的取代作用
取上述色素乙醇提取液少许于试管中，加入5%HCl数滴，摇匀，直至溶液出现褐绿色，当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记载溶液颜色变化情况。
六、注意事项
1、为了避免叶绿素的光分解，操作应在弱光下进行。
2、研磨时间尽可能短些，以不超过两分钟为宜。
3、在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白絮状物，溶液浑浊，且不分层。可激烈摇匀，放在30～40℃的水浴中加热，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。
七、实验报告
1、将纸层析法分离叶绿体色素的实验结果贴在实验报告纸上，并给予分析。
《你看着少抄点》

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黄平县14790274205： 叶绿体色素的提取及理化性质的鉴定叶绿素皂化反应的原因及现象,还有其与浓盐酸,醋酸铜的反应 - ？
符欧安必：[答案] 首先声明一下,我不是学生化的,我的见解仅供你参考.我以前做过叶绿素的提取及使用的工作,叶绿素皂化的原因可能是提纯阶段做得不够好,纯度不够高,现象就是产物很快由绿色转变成了黄色,甚至产物就是黄色的,最好用浓度很...

黄平县14790274205： 叶绿体色素的提取及理化性质的鉴定 - ？
符欧安必： 首先声明一下,我不是学生化的,我的见解仅供你参考.我以前做过叶绿素的提取及使用的工作,叶绿素皂化的原因可能是提纯阶段做得不够好,纯度不够高,现象就是产物很快由绿色转变成了黄色,甚至产物就是黄色的,最好用浓度很高的乙...

黄平县14790274205： 提取与分离叶绿体色素的原理分别是什么 - ？
符欧安必：[答案] 叶绿体色素可以溶于有机溶剂,所以可以用无水乙醇提取. 分离:叶绿体色素在层析液中溶解度不同,溶解度大的随层析液扩散速度快,反之则慢,即可分开

黄平县14790274205： 高一生物 叶绿体中色素的提取与分离 - ？
符欧安必： 叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光,所以在对着光的情况下看到的叶绿素反射的光波呈现绿色,而在背对着光源时看到的是叶绿素吸收的光波的颜色呈现红色!

黄平县14790274205： 叶绿体色素用什么方法可以提取与分离? - ？
符欧安必： 叶绿体中含有绿色素(包括叶绿素a和叶绿素b)和黄色素(包括胡萝卜素和叶黄素)两大类.它们与类囊体膜上的蛋白质相结合,而成为色素蛋白复合体,这两类色素都不溶于水,而溶于有机溶剂,故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取.提取液可用色层分析的原理加以分离.因吸附剂对不同物质的吸附力不同,当用适当的溶剂推动时,混合物中各成分在两相(流动相和固定相)间具有不同的分配系数,所以它们的移动速度不同,经过一定时间层析后,便将混合色素分离. http://www.bio1000.com/zt/focus/354109.html 973计划,973计划首席科学家,973项目,国家973计划

黄平县14790274205： 叶绿素的提取与分离 - ？
符欧安必： 原理:层析液是一种脂溶性很强的有机溶剂.叶绿体中的色素在层析液中的溶解度不同:溶解度高的随层析液的滤纸上扩散得快;溶解度低的随层析液在滤纸上扩散的慢.这样,几分钟之后,叶绿体中的色素就会在扩散过程中分离出来.由于溶解度大的扩散的快,也就是相对在滤纸上的距离远,所以在滤纸的上方,而溶解度小的,扩散的慢,也就在滤纸的下方.至于宽度是他们各自在叶绿体中的含量,含量越多,越宽. 含量从高到低依次是:叶绿色a>叶绿素b>叶黄素>胡萝卜素 在滤纸上从上到下依次是:胡萝卜素,叶黄素,叶绿素a,叶绿色b 希望对你有帮助,有不懂的再问我

黄平县14790274205： 关于“叶绿素色素的提取和分离”的实验 - ？
符欧安必： “将干燥的定性滤纸条剪成长与宽略小于试管长与宽的滤纸条”是因为,你还要放到试管中,让它跑开,在后面的步骤里.滤纸条一端剪去两个角使之呈梯形,是为了防止滤液就沿两边往上跑,这样就分不开了.就象毛细管一样的那个原理.距离1cm是因为等下要放在分离液中跑,又不能让叶绿素浸到分离液中啊.用铅笔可以划得整齐,这样让每一种色素都有共同的起点,才分得开!

黄平县14790274205： 叶子中的色素怎样提取 - ？
符欧安必： 叶子中的色素,即提取叶子中叶绿体中的色素. 叶子中的色素提取可以用分离色素(纸层析法): 不同色素在层析液中的溶解度不同,溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快,反之则慢,从而使各种色素相互分离. 绿叶中的色素是有机物,能...

黄平县14790274205： 生物高一实验“探究叶绿体色素的提取和分离”原理,步骤,现象及结论,及重点(简短~~)非常感谢~~ - ？
符欧安必： 色素提取的原理:色素能溶解与有机溶剂. 色素提取的步骤:取绿色叶片的叶肉部分-----加无水乙醇、碳酸钙、二氧化硅,研磨-----过滤----- 取滤液. 色素分离的原理:不同种类的色素在层析液中的溶解度不同,在滤纸条上的扩散速度不同. 色素分离的步骤:画滤液细线-----纸上层析. 结论:说明绿色叶片中含有四种色素.

黄平县14790274205： 生物 叶绿素中色素的提取与分离 - ？
符欧安必： 选择C分析: A选项:丙酮是能够溶解叶绿体色素的有机溶剂.A是正确的.B选项:在层析前,滤纸条一端剪去两个角使之呈梯形,是为了防止滤液就沿两边往上跑,这样就分不开了.就象毛细管一样的那个原理.所以说层析液没过细线就没有意义了,等于实验失败.B是正确的.C选项:叶绿素中色素的提取与分离实验的目的主要是学习叶绿体中色素的提取和分离的方法,了解叶绿体色素的种类.并不能了解叶绿体中的各种色素的吸收光谱.C是错误的.D选项:深绿色叶片所含的叶绿素较多,比较容易提取.D是正确的.希望可以帮到你咯!