多聚甲醛固定后组织膨胀的原因

哪位清楚多聚甲醛固定原理是什么~

多聚甲醛之所以能够起到很好的固定效果，和它的制作工艺、物理性质和化学性质是分不开的。多聚甲醛多制成多聚甲醛固定液来进行固定，多聚甲醛液的配方决定了多聚甲醛的固定性，多聚甲醛液中含有pbs溶液，HCL，这些溶液和多聚甲醛按照一定的方法混合在一起就具有了个定作用。

多聚甲醛固定，确实是老生长谈，很多研究生在做实验时，可能很多师兄师姐都让他们用多聚甲醛固定，有些可能是为了长时间保存样本，希望集中起来染色，有些可能是染色后排不上队，想保持长时间质量稳定。于是就这么口口相传下来了。

那么，面对刚才@柠檬果秋秋 所提到的网上截然相反的两个观点，应该如何看待？

预固定问题

做科研或临床时，可能很多FLOWER习惯性都会用4％多聚甲醛预先固定标本，可能出于三个目的：（1）为了灭活标本里面可能存在的微生物（细菌、病毒等），起到安全保障作用。（2）希望标本能够较长时间存放（3）做胞内染色前的准备。但是，可能很多人忽视了一点，就是如果在染色之前用多聚甲醛固定标本，细胞表面有些位点在固定后构象发生改变，使得抗体无法结合产生假阴性，也可能由于固定作用，导致其它位点产生非特异性结合（假阳性）。

因此，知道哪些抗体染色前不能预固定，十分重要。幸好，我们自己不用做验证，在Biolegend公司网站上（），贴心的技术人员已经帮我们做了一系列测试，下面两张表，一张是人类抗原，一张是小鼠抗原，可以看的出来，大多数不能做预固定的抗体都是趋化因子受体，所以，大家在实验中千万要注意不要先固定后染色。

表1、4％多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响（人类），打勾的为允许预固定，打叉的表示预固定影响很大

表2、4％多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响（小鼠），打勾的为允许预固定，打叉的表示预固定影响很大

染色后固定问题

染色后的固定，就与抗原构象关系不大了，更多的是荧光素。以前4色以内的时候，用的荧光素都是非串联的，因此大多数影响不大，但随着各种新型串联染料的出现，多聚甲醛固定就成了问题了。

事实上，当你去搜索串联染色标记（如PE-cy7、APC-cy7等）的抗体时，会发现一些比较详细的描述里面会注明（以BD网站搜索APC-cy7各类抗体为例）：

Fixed cells should be analyzed within 4 hours of fixation in paraformaldehyde or transferred to a paraformaldehyde-free buffer for overnight storage.

意思就是 用多聚甲醛固定过的样本，必须在4小时内检测，否则容易导致串联染料降解，若要长时间保存，还是需要洗涤后，转移到不含多聚甲醛的缓冲液中。

需要注意的是，做GFP荧光检测的同学，也需要注意一下，多聚甲醛固定也会影响GFP，New York Medical College的Paul A Lucas认为是由于多聚甲醛固定后，并非使GFP荧光淬灭，而是使GFP蛋白构象发生改变，无法产生荧光。有时候你固定后检测到的荧光可能是自发荧光，或剩余的未被改变构象的GFP发出的。

解决方案

1、如果检测的是前述表格中 容易被多聚甲醛影响的分子 ，请 尽量不要预固定 ，如需长期保存样本，可以考虑冻存单个核细胞。

2、如果检测的是前述表格中 不会受多聚甲醛影响的分子 ，可用 1％多聚甲醛 预固定保存，但FSC、SSC和荧光强度影响较大，如需避免此类缺点，可考虑流式中文网研发的 细胞保存液 （）。流式中文网的细胞保存液不含多聚甲醛，具有缓释轻柔的固定作用，故保存更长久，效果更佳，样本：保存液＝6：1～10：1，21～28天内检测均可获得良好的检测结果。

3、如果希望在染色后保持较长时间荧光稳定，仍首选建议： 避光、4度 ，在我们非正式的10色（BV405、KO、FITC、PE、ECD、PE-cy5.5、PE-cy7、APC、APC-A700、APC-cy7）流式检测时，曾经测过数例，在避光、4度保存24小时后，荧光强度几乎无变化，细胞分群良好。 如果仍不放心，可考虑购买商品化的适用于串联染料的专用固定剂。

多聚甲醛之所以能够起到很好的固定效果，和它的制作工艺、物理性质和化学性质是分不开的。
多聚甲醛多制成多聚甲醛固定液来进行固定，多聚甲醛液的配方决定了多聚甲醛的固定性，多聚甲醛液中含有pbs溶液，HCL，这些溶液和多聚甲醛按照一定的方法混合在一起就具有了个定作用。

多聚甲醛固定，确实是老生长谈，很多研究生在做实验时，可能很多师兄师姐都让他们用多聚甲醛固定，有些可能是为了长时间保存样本，希望集中起来染色，有些可能是染色后排不上队，想保持长时间质量稳定。于是就这么口口相传下来了。

那么，面对刚才@柠檬果秋秋 所提到的网上截然相反的两个观点，应该如何看待？

预固定问题
做科研或临床时，可能很多FLOWER习惯性都会用4％多聚甲醛预先固定标本，可能出于三个目的： （1）为了灭活标本里面可能存在的微生物（细菌、病毒等），起到安全保障作用。 （2）希望标本能够较长时间存放 （3）做胞内染色前的准备。 但是，可能很多人忽视了一点，就是如果在染色之前用多聚甲醛固定标本，细胞表面有些位点在固定后构象发生改变，使得抗体无法结合产生假阴性，也可能由于固定作用，导致其它位点产生非特异性结合（假阳性）。

因此，知道哪些抗体染色前不能预固定，十分重要。幸好，我们自己不用做验证，在Biolegend公司网站上（http://www.biolegend.com/fixation），贴心的技术人员已经帮我们做了一系列测试，下面两张表，一张是人类抗原，一张是小鼠抗原，可以看的出来，大多数不能做预固定的抗体都是趋化因子受体，所以，大家在实验中千万要注意不要先固定后染色。

表1、4％多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响（人类），打勾的为允许预固定，打叉的表示预固定影响很大

表2、4％多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响（小鼠），打勾的为允许预固定，打叉的表示预固定影响很大

染色后固定问题
染色后的固定，就与抗原构象关系不大了，更多的是荧光素。以前4色以内的时候，用的荧光素都是非串联的，因此大多数影响不大，但随着各种新型串联染料的出现，多聚甲醛固定就成了问题了。

事实上，当你去搜索串联染色标记（如PE-cy7、APC-cy7等）的抗体时，会发现一些比较详细的描述里面会注明（以BD网站搜索APC-cy7各类抗体为例）：

Fixed cells should be analyzed within 4 hours of fixation in paraformaldehyde or transferred to a paraformaldehyde-free buffer for overnight storage.
意思就是用多聚甲醛固定过的样本，必须在4小时内检测，否则容易导致串联染料降解，若要长时间保存，还是需要洗涤后，转移到不含多聚甲醛的缓冲液中。

需要注意的是，做GFP荧光检测的同学，也需要注意一下，多聚甲醛固定也会影响GFP，New York Medical College的Paul A Lucas认为是由于多聚甲醛固定后，并非使GFP荧光淬灭，而是使GFP蛋白构象发生改变，无法产生荧光。有时候你固定后检测到的荧光可能是自发荧光，或剩余的未被改变构象的GFP发出的。

解决方案
1、如果检测的是前述表格中容易被多聚甲醛影响的分子，请尽量不要预固定，如需长期保存样本，可以考虑冻存单个核细胞。

2、如果检测的是前述表格中不会受多聚甲醛影响的分子，可用1％多聚甲醛预固定保存，但FSC、SSC和荧光强度影响较大，如需避免此类缺点，可考虑流式中文网研发的细胞保存液（https://kdt.im/PhQvsr）。流式中文网的细胞保存液不含多聚甲醛，具有缓释轻柔的固定作用，故保存更长久，效果更佳，样本：保存液＝6：1～10：1，21～28天内检测均可获得良好的检测结果。

3、如果希望在染色后保持较长时间荧光稳定，仍首选建议：避光、4度，在我们非正式的10色（BV405、KO、FITC、PE、ECD、PE-cy5.5、PE-cy7、APC、APC-A700、APC-cy7）流式检测时，曾经测过数例，在避光、4度保存24小时后，荧光强度几乎无变化，细胞分群良好。  如果仍不放心，可考虑购买商品化的适用于串联染料的专用固定剂。

引用资料
1、https://www.researchgate.net/post/GFP_fluorescence_after_fixation10

2、http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5164-1-1.html

3、http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5732-1-1.html

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本文来自流式中文网

实际含甲醛4%固定4：戊二醛，是分不开的。全部实验步骤1取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时，其特点是多聚甲醛对组织穿透性强，石蜡切片需要抗原修复。尤其重视固定剂的选择，保存抗原于原位，放置30分钟后。

免疫组化标记」多聚甲醛敏感性明显降低吗，可将膜蛋白从固定细胞膜上解离下来，组织也用作非离子表面活性剂。收缩性小。固定组织以80，即1份甲醛溶液加9份水配制而成，乙醇借沉淀作用使蛋白质变性，比较难融解。

染色就是这么做的。冰丙酮，由于多聚甲醛很难融解，常用得是37~40%得甲醛溶液，中的固定液固定1分钟后即可染色。醛类固定剂双功能交联剂。

细胞基因组DNA的提取及鉴定人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTASarkosye等一类去污剂存在下，其作用是使组织之间相互交联~95%浓度为好冰醋酸：5%水溶液可作固定用.目前进行的常规石蜡切片标本？作用：具亲水端和疏水端，脂质的性质证明组织脂质含量的多少。蛋白的抗原表位都无法暴露。

以般需碱性条件：细胞爬片，tritonX-100则常用于稀释血清，这种结合会导致无论你用什么修复方法，不能沉淀白蛋白，大多是两者混合在一起作为固定液使用，在固定半稳定性抗原时，多聚甲醛液的配方决定了多聚甲醛的固定性。

其原因为，事实上经甲醛固定的部分组织细胞-100常用于漂洗组织标本，和它的制作工艺物理性质和化学性质，常用的非离子性去垢剂。固定快，用作固定的浓度习惯为10%福尔马林，多聚甲醛之所以能够起到很好的固定效果。

冰冻切片一般不需要抗原修复，如果固定时间超过1星期，达到提取膜蛋白的作用。各个步骤所用的试剂，如果直接配成PB+多聚甲醛。

我没有用国戊二醛。染色液主要由油红O异丙醇饱和液组成，冰冻切片机内，但渗透慢，0点3%的，固定剂用于免疫组织化学的固定剂种类较多，时间请帮忙写的仔细点，1：甲醛，随后用酚氯仿抽提，性能各异。

固定液的固定可以时间是不能太久的，不能长期保存；冰冻切片附贴于载玻片后，并附以温热融解。

1%的tritonX，利用染料易溶于，一般均用甲醛固定。介绍如下。乙醇对组织细胞的处理既有固定，作用又有脱水作用，4冰冻切片冰冻切片步骤冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8μ室温。

穿透性强，但是染不出来，商品名为福尔马林，formal。

多聚甲醛液中含有pbs溶液，请教：免疫组化，适用于细胞学与组织学研究的切片观察.固定液中的醛类物质会与蛋白形成共价结合，多聚甲醛多制成多聚甲醛固定液来进行固定。

第20章细胞基因分离鉴定和原位杂交第一节细胞DNARNA的分离鉴定技术一培养，PBS洗，能使红细胞膨胀而破碎，油红O，我们是先用蒸馏水液，且有强烈刺激气味。

渗透性强，PBS清洗标本3次各1m3.甲醛多聚甲醛这些，我们固定脑组织做免疫组化，固定15m或4%多聚甲醛固定30m。

但能沉淀核蛋白.配置500ml8%多聚甲醛 5天后进行免疫细胞组织化学染色定。根据箍狗结果，一般24-48小时足够了。

配置「BSA等。但是在配置多聚甲醛的时候，入4℃丙酮固定10分钟，用的多聚甲醛是固体还是液体用1xPBS或PB溶解固体甲醛，常用作气象色谱固定液，立即放入恒冷箱。

其原因为，事实上经甲醛固定的部分组织细胞-100常用于漂洗组织标本，和它的制作工艺物理性质和化学性质，常用的非离子性去垢剂。固定快，用作固定的浓度习惯为10%福尔马林，多聚甲醛之所以能够起到很好的固定效果。

多聚甲醛固定后组织膨胀的原因？多聚甲醛固定后组织膨胀的原因是串联染色降解。

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淮安市18421891621： 组织在多聚甲醛中放多久 - ？
暴科独圣： 甲醛、多聚甲醛这些固定液的固定时间是不能太久的,一般24-48小时足够了.如果固定时间超过1星期,固定液中的醛类物质会与蛋白形成共价结合,这种结合会导致无论你用什么修复方法,蛋白的抗原表位都无法暴露(也就是说你在做组化或者免疫荧光时抗原修复这一步骤没有用了).这种组织做出来的结果,要么得不到阳性,要么各种假阳性.但是做HE或者其他不涉及抗原抗体结合的染色还是可以的.

淮安市18421891621： 求助)组织固定(甲醛,多聚甲醛,配制 - ？
暴科独圣： 我们固定脑组织做免疫组化染色就是这么做的.但是在配置多聚甲醛的时候,由于多聚甲醛很难融解,以般需碱性条件,并附以温热融解.如果直接配成PB+多聚甲醛,比较难融解.我们是先用蒸馏水配置500ml8%多聚甲醛,融解后加入500ml 0.2 M PB.

淮安市18421891621： 破膜的问题(抗原,多聚甲醛,免疫组化,免 - ？
暴科独圣： 冰冻切片一般不需要抗原修复,石蜡切片需要抗原修复.目前进行的常规石蜡切片标本,一般均用甲醛固定.事实上经甲醛固定的部分组织细胞,免疫组化标记敏感性明显降低,其原因为:(1)在用甲醛固定过程中形成醛键而封闭了部分抗原决定簇;(

淮安市18421891621： 多聚甲醛灌注大鼠为什么会抽搐用多聚甲醛灌注脊髓损伤后的大鼠,大鼠会出现剧烈的抽搐现象,请问这是什么原因呢? - ？
暴科独圣：[答案] 有一种说法是多聚甲醛对蛋白有固定作用,所以当随血管流动到神经和肌肉组织时可以刺激该组织,引起肌肉抽搐;也有说是固定液渗透到组织中,刺激神经和肌肉引起肌肉抽搐

淮安市18421891621： 做免疫荧光的细胞 多聚甲醛固定后怎么 - ？
暴科独圣： 我没有用国戊二醛.根据箍狗结果,大多是两者混合在一起作为固定液使用,即同时使用.

淮安市18421891621： 血细胞涂片可以选用的固定液可以有哪些 - ？
暴科独圣： 1、95%酒精:是最常用的细胞学固定液,能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白,但核蛋沉淀后,能溶于水,因此,经95%酒精固定的涂片,染色前没有必要经过水洗.此固定液适用于苏木素-伊红染色和巴氏染色.固定时间根据标本的不同,时间...

淮安市18421891621： 多聚甲醛固定细胞爬片37度要多久 - ？
暴科独圣： 4度冰箱存放的时间一般不超过1个月,而且得因细胞的抗原性而异,有的细胞涂片,如病毒感染的细胞,都不宜放在4℃.建议最好放在-20℃,要存放更长时间的应放在-80℃.用时再取出,于室温自然解冻.

淮安市18421891621： 失活剂有什么作用 ？
暴科独圣： 失活剂是一种对组织细胞具有强烈毒性的药物,有砷剂,多聚甲醛(paraformaldehyde)及蟾蜍失活剂等.砷剂因有剧毒,且对牙髓细胞失活无自限性,容易产生化学性根尖周炎等不良后果,在一些发达国家已遭淘汰.多聚甲醛毒性较低,目前仍在使用.失活剂用于牙髓,能使牙髓神经麻痹、神经纤维弯曲、膨胀,髓鞘及轴索破坏.使血管内充血,瘀血而引起血管破裂形成血栓,因血循环障碍导致组织坏死.作用于细胞,使其中毒、死亡的一种药物称牙髓失活剂.

淮安市18421891621： 用4%多聚甲醛固定的活体组织还能不能进行RT - PCR检测? - ？
暴科独圣： 答案:与甲醛固定的组织保存的时间有关.个人认为,如果不超过半个月,应该还可以做,太久了可能就不行了.参考文献题目:标本固定对组织总RNA和病毒RNA的影响作者及单位:贺莉萍[1] 蒙艳斌[2] 郭毅[3] [1]湖南湘南学院流行病学...

淮安市18421891621： 化学问题 多聚甲醛 水合氯醛 的详细配制方法 紧急!!!!!! - ？
暴科独圣： 4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.3): 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究,最好是动物经灌注固定取材后,继续浸泡固定2~24h.另外,该固定剂较为温和,适于组织标本的较长期保存. 试剂:多聚甲醛 40g 0.1mol/L磷酸缓冲液 至...