鞭毛染色原理及注意事项有哪些

鞭毛染色的方法及原理的详细说明~

鞭毛染色原理
鞭毛是细菌的运动“器官”，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的沉淀作用，染色前先用媒染剂(如单宁酸或明矾钾)处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色（如碱性复红、硝酸银、结晶紫）。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。目前，细菌鞭毛染色方法根据染色剂的不同，可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法、镀银染色法和荧光蛋白染色法6类，前5类方法的媒染剂成分中均含有单宁酸。

鞭毛染色方法
1.碱性复红法和副品红法：
1926年由Gray首创，其媒染液成分包括20%丹宁酸水溶液2.0ml，硫酸钾铝饱和水溶液5ml，饱和氯化汞水溶液2ml，3%碱性复红乙醇（95%）溶液0.4ml，临用前混合，且需过滤后方可使用。染片时，媒染剂染色约6min，具体时间尚需在试验中摸索确定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸复红染液，染片时需要1小片吸水纸盖在涂片上，染色3min。由于该方法媒染剂混合物不稳定、操作复杂、经验性强。Leifson于1930年建立了副品红法，并于1938年和1951年两次对该方法进行了改良，称为Leifson方法。染色试剂由3种溶液组成：A为1.5%NaCl水溶液，B为3%单宁酸水溶液，C为乙酸副品红0.9g，碱性副品红0.3g溶解于100ml95%乙醇溶液中。使用时把等体积A和B混合，然后再加2体积C与之相混。该试剂冷藏可保存1～2个月。
2. 结晶紫法：
又称Ryu法，1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等进行了改良。媒染剂：5%石碳酸10 ml，2g单宁酸和10 ml饱和硫酸钾铝。染色剂：饱和结晶紫乙醇溶液，即12g结晶紫溶于100 ml无水乙醇中。使用时把10份媒染剂与1份染色剂混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色试剂，采用湿片技术进行鞭毛染色，虽然可以观察到细菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法优点是试剂比较稳定，目前Difco公司已经研制出该方法的商品试剂盒，但染色效果亦不甚理想.
3. 维多利亚蓝B法：
1990年由Inoue等报道日本制药株式会社Shionogi Seiyaku研制出一种细菌鞭毛染色商品试剂盒。其试剂组成包括维多利亚蓝B、苯酚、单宁酸和硫酸钾铝，染色约需7min。该试剂保存期约为6个月，关于其染色效果虽然有过一篇文献评述，但却没有采用评分法进行评价，很难判断其染色效果。
4. 镀银染色法：1958年Rhodes根据Fontana的螺旋体改良镀银染色法，建立了一种细菌鞭毛镀银染色法。试剂分为媒染剂和银染剂。媒染液：10%单宁酸10 ml加5 ml饱和硫酸钾铝水溶液，再加1 ml苯胺饱和水溶液形成沉淀，通过摇动又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液，稳定10 min后使用。银染液：配制5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml备用，再缓慢加入浓氨水（比重0.880）使形成的沉淀刚好重新溶解，最后把备用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到摇动后呈现轻微而稳定的薄雾状溶液为止，避光保存，可稳定数周。用媒染液染片3～5min，蒸馏水充分洗涤后，再把银染液滴加至涂片上。加热至接近沸腾，染色3～5min。由于Rhodes镀银染色法媒染液成分复杂、操作繁锁，所以1965年Blenden等改良了细菌鞭毛镀银染色法的配方。试剂A：100 ml蒸馏水中加入5 g单宁酸，1.5 gFeCl3，15%福尔马林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。试剂B：使用2% AgNo3，其他同于Rhodes，但试剂不稳定，要求在4h内使用，并用要用氨水调pH至10。试剂A染片2～4min，试剂B染色30 s，不需加热。由于以上两种镀银染色方法都要使用营养琼脂斜面培养物，并且需用无菌蒸馏水悬浮菌液制片，未采用评分法评价镀银染色方法。因此1977年，West等对镀银染色法进一步改良，制备涂片时直接使用血平板，评价染色效果首次使用5分制，通过该评价方法证明了加热银染液染片可以提高染色效果。试剂配方：媒染液为饱和硫酸钾铝水溶液25 ml，10%单宁酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃保存，染色液配制同Rhodes，但需避光5℃保存。媒染液染片4min，银染液滴加至涂片上加热至微冒蒸汽，染色4min。同时West等还对使用不同培养基进行染色效果评价，包括半固体动力培养基、血琼脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜面，其中半固体动力培养基和TSA斜面25℃，培养18～24h；血琼脂平板35～37℃，培养18～24h。评价结果血琼脂平板35～37℃，培养18～24h不适于细菌鞭毛染色，而半固体动力培养基和TSA斜面25℃，培养18～24h适合于细菌鞭毛染色，同时也证明了使用福尔马林处理标本制备涂片并不能有效阻止鞭毛脱落。由于镀银染色法媒染液不稳定，需避光5℃保存，1992年Porter等继续改良该方法，其试剂配方同West等的方法，只是媒染剂避光室温可保存数月，延长媒染剂染色时间为8 min，染色液不需加热，只染30 s，制备涂片程序略有不同。使用TSA平板，36℃培养24h，但遗憾的是Porter等只使用了1种细菌（奇异变形杆菌）进行研究。于是1994年Finegan等进一步证实使用过期媒染剂进行镀银染色可以增强鞭毛染色效果，并使用4种细菌（绿脓假单胞、奇异变形杆菌、黏质沙雷菌、枯草芽孢杆菌），用trypitcase soy肉汤及其琼脂平板，26℃培养24h。试剂配方仍不变，媒染液放置1、2、4、8、16周后进行染色，媒染液染色8 min，银染液染色30～60 s，不需加热。这4种细菌均染色成功，从而证明媒染液可至少放置16周。
5、鞭毛的负染：
菌悬液，直接滴在铜网上，1－2分钟后，吸去多余的菌液（似干非干的程度），再滴上0.1％的磷钨酸溶液，1分钟后，吸去多余的染液，然后就可以在电镜下观察了。一般染色后十五天之内看电镜。时间太长效果不好。这是我试验用的方法。
6、银染法：
首先染色用玻片一定要干净，洗液泡过之后蒸馏水冲洗干净。涂片的时候菌千万别涂得太多。第一部染色时，可将玻片置于水浴锅内，温度保持在35度,盖上盖（主要是保持一定的湿度，防止染色液变干不利于冲洗，这步非常有用)。一定要将第一步使用的媒染液冲洗干净，否则影响染色效果，背景可能非常 脏。其他的步骤参考书上的资料进行，一般没什么问题。我用这种方法染单鞭毛的弧菌，效果非常好。

1.镀银法染色
（1）清洗玻片 选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡5—6天，使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。
（2）菌液的制备及制片：菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的半固体牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）。用消过毒的盖玻片切取培养基边缘的小块琼脂放进试管中，注意要轻放并轻轻摇动，将该试管放在37℃恒温箱中静置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。要注意的是菌液的含菌数量一定要少!
干燥后的处理
(1) 干燥后用稀盐酸或稀氢氧化钠滴,并立即倾斜玻片,使酸(碱)液流下,并自然干燥.
(2) 用冲稀的头发顶型剂滴加,处理一到三分钟(具体的要实验才能知道),并自然干燥.
用于鞭毛染色的菌体是用半固体培养基才用支点法培养的。方法是将0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中，在培养皿中间放三块成分减半（但是NaCl不减半,琼脂为正常百分比）的，恒温培养12-24h后，取扩散菌落的边缘制作涂片。
（3）染色
①滴加A液，染4—6min。
②用蒸馏水充分洗净A液。
③用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.5—1min（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区）。
④用蒸馏水洗，自然干燥。
（4）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。
结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。


下面就如何做好鞭毛染色谈几点意见供参考。

1．要选好菌种。一般用周生鞭毛菌（如普通变形杆菌Proteus vulgaris）较好，这类菌的鞭毛多而长易于观察。

2．要注意培养条件和培养时间：①用点接法在新配制的牛肉膏蛋白胨半固体平板上接种。一般一个平板点接3～4处。经比较用半固体培养基培养出来的菌体活动度大，鞭毛长且多，易于染色，这可能与半固体培养基更适于菌体运动、鞭毛生长较好有关。用点接种法在平板上接种更易于挑取边缘幼龄的菌体。②培养时间要严格掌握，一般培养9～12h较好，菌龄超过15h，鞭毛染色效果较差，这可能与老龄菌体活动度降低、鞭毛易脱落有关。冰箱长期保存的菌种不宜直接用于鞭毛染色，需用新制备的斜面连续转接2～3次后再染色。

3．所用玻片的准备：①用过的旧载片要选择光滑无划痕的，放入已加入洗衣粉的蒸馏水中煮沸（如能预先过滤去渣更好），煮毕冷却后，清水洗净，放入浓洗液中浸泡24h，取出用清水冲洗残酸，最后用蒸馏水洗净，沥干水并放于95％乙醇中脱水，取出后烧去酒精，即可使用。②新的载片虽没有油污、划痕，但含游离碱较多，所以要用2％盐酸浸泡几小时，用自来水冲洗干净，然后再用蒸馏水洗净，沥干后再用效果较好。

4．染色液一定要新鲜，特别是硝酸银染色法中更是如此，A染液和B染液最好都现用现配，A液一般不能放置。

5．染色过程中的细节也应充分注意：①取菌要取菌落边缘的幼龄菌体。②取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可，不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开；将载片稍倾斜，使菌液散开即可，否则鞭毛易脱落，造成染色失败。③鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用热风吹干，不能热固定，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落，影响观察。④A染液染3～5min，其后用蒸馏水（自来水效果差）冲洗时一定要充分，否则加B染液后，背景很脏，鞭毛不易被观察到，影响实验效果。⑤加B染液后，将玻片稍加热（但不能太热，更不能沸腾或蒸干）使其微冒蒸汽，30～60s，染色效果较不加热为好。⑥B染液染完后，用蒸馏水冲洗比用自来水冲洗效果好。


还有很多好的网站:
http://kczy.zjut.edu.cn/microbiology/Article_Show.asp?ArticleID=311
http://nhjy.hzau.edu.cn/kech/wswx/cn/syzd/shiyan/06.htm

鞭毛染色原理
鞭毛是细菌的运动“器官”，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的沉淀作用，染色前先用媒染剂(如单宁酸或明矾钾)处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色（如碱性复红、硝酸银、结晶紫）。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。目前，细菌鞭毛染色方法根据染色剂的不同，可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法、镀银染色法和荧光蛋白染色法6类，前5类方法的媒染剂成分中均含有单宁酸。

鞭毛染色方法
1.碱性复红法和副品红法：
1926年由Gray首创，其媒染液成分包括20%丹宁酸水溶液2.0ml，硫酸钾铝饱和水溶液5ml，饱和氯化汞水溶液2ml，3%碱性复红乙醇（95%）溶液0.4ml，临用前混合，且需过滤后方可使用。染片时，媒染剂染色约6min，具体时间尚需在试验中摸索确定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸复红染液，染片时需要1小片吸水纸盖在涂片上，染色3min。由于该方法媒染剂混合物不稳定、操作复杂、经验性强。Leifson于1930年建立了副品红法，并于1938年和1951年两次对该方法进行了改良，称为Leifson方法。染色试剂由3种溶液组成：A为1.5%NaCl水溶液，B为3%单宁酸水溶液，C为乙酸副品红0.9g，碱性副品红0.3g溶解于100ml95%乙醇溶液中。使用时把等体积A和B混合，然后再加2体积C与之相混。该试剂冷藏可保存1～2个月。
2. 结晶紫法：
又称Ryu法，1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等进行了改良。媒染剂：5%石碳酸10 ml，2g单宁酸和10 ml饱和硫酸钾铝。染色剂：饱和结晶紫乙醇溶液，即12g结晶紫溶于100 ml无水乙醇中。使用时把10份媒染剂与1份染色剂混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色试剂，采用湿片技术进行鞭毛染色，虽然可以观察到细菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法优点是试剂比较稳定，目前Difco公司已经研制出该方法的商品试剂盒，但染色效果亦不甚理想.
3. 维多利亚蓝B法：
1990年由Inoue等报道日本制药株式会社Shionogi Seiyaku研制出一种细菌鞭毛染色商品试剂盒。其试剂组成包括维多利亚蓝B、苯酚、单宁酸和硫酸钾铝，染色约需7min。该试剂保存期约为6个月，关于其染色效果虽然有过一篇文献评述，但却没有采用评分法进行评价，很难判断其染色效果。
4. 镀银染色法：1958年Rhodes根据Fontana的螺旋体改良镀银染色法，建立了一种细菌鞭毛镀银染色法。试剂分为媒染剂和银染剂。媒染液：10%单宁酸10 ml加5 ml饱和硫酸钾铝水溶液，再加1 ml苯胺饱和水溶液形成沉淀，通过摇动又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液，稳定10 min后使用。银染液：配制5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml备用，再缓慢加入浓氨水（比重0.880）使形成的沉淀刚好重新溶解，最后把备用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到摇动后呈现轻微而稳定的薄雾状溶液为止，避光保存，可稳定数周。用媒染液染片3～5min，蒸馏水充分洗涤后，再把银染液滴加至涂片上。加热至接近沸腾，染色3～5min。由于Rhodes镀银染色法媒染液成分复杂、操作繁锁，所以1965年Blenden等改良了细菌鞭毛镀银染色法的配方。试剂A：100 ml蒸馏水中加入5 g单宁酸，1.5 gFeCl3，15%福尔马林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。试剂B：使用2% AgNo3，其他同于Rhodes，但试剂不稳定，要求在4h内使用，并用要用氨水调pH至10。试剂A染片2～4min，试剂B染色30 s，不需加热。由于以上两种镀银染色方法都要使用营养琼脂斜面培养物，并且需用无菌蒸馏水悬浮菌液制片，未采用评分法评价镀银染色方法。因此1977年，West等对镀银染色法进一步改良，制备涂片时直接使用血平板，评价染色效果首次使用5分制，通过该评价方法证明了加热银染液染片可以提高染色效果。试剂配方：媒染液为饱和硫酸钾铝水溶液25 ml，10%单宁酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃保存，染色液配制同Rhodes，但需避光5℃保存。媒染液染片4min，银染液滴加至涂片上加热至微冒蒸汽，染色4min。同时West等还对使用不同培养基进行染色效果评价，包括半固体动力培养基、血琼脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜面，其中半固体动力培养基和TSA斜面25℃，培养18～24h；血琼脂平板35～37℃，培养18～24h。评价结果血琼脂平板35～37℃，培养18～24h不适于细菌鞭毛染色，而半固体动力培养基和TSA斜面25℃，培养18～24h适合于细菌鞭毛染色，同时也证明了使用福尔马林处理标本制备涂片并不能有效阻止鞭毛脱落。由于镀银染色法媒染液不稳定，需避光5℃保存，1992年Porter等继续改良该方法，其试剂配方同West等的方法，只是媒染剂避光室温可保存数月，延长媒染剂染色时间为8 min，染色液不需加热，只染30 s，制备涂片程序略有不同。使用TSA平板，36℃培养24h，但遗憾的是Porter等只使用了1种细菌（奇异变形杆菌）进行研究。于是1994年Finegan等进一步证实使用过期媒染剂进行镀银染色可以增强鞭毛染色效果，并使用4种细菌（绿脓假单胞、奇异变形杆菌、黏质沙雷菌、枯草芽孢杆菌），用trypitcase soy肉汤及其琼脂平板，26℃培养24h。试剂配方仍不变，媒染液放置1、2、4、8、16周后进行染色，媒染液染色8 min，银染液染色30～60 s，不需加热。这4种细菌均染色成功，从而证明媒染液可至少放置16周。
5、鞭毛的负染：
菌悬液，直接滴在铜网上，1－2分钟后，吸去多余的菌液（似干非干的程度），再滴上0.1％的磷钨酸溶液，1分钟后，吸去多余的染液，然后就可以在电镜下观察了。一般染色后十五天之内看电镜。时间太长效果不好。这是我试验用的方法。
6、银染法：
首先染色用玻片一定要干净，洗液泡过之后蒸馏水冲洗干净。涂片的时候菌千万别涂得太多。第一部染色时，可将玻片置于水浴锅内，温度保持在35度,盖上盖（主要是保持一定的湿度，防止染色液变干不利于冲洗，这步非常有用)。一定要将第一步使用的媒染液冲洗干净，否则影响染色效果，背景可能非常 脏。其他的步骤参考书上的资料进行，一般没什么问题。我用这种方法染单鞭毛的弧菌，效果非常好。

鞭毛染色原理及注意事项有哪些
鞭毛是细菌的运动“器官”，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强

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珠晖区18542874048： 用鞭毛染色法准确鉴定一株细菌菌是否具有鞭毛,要注意哪些环节? - ？
尹肯强力：[答案] 1.细菌要用新培养的对数生长期的 2.培养基中不能含有抑制鞭毛的物质; 3.涂菌时要用蒸馏水而不是生理盐水; 4.比片要干净; 5.不能加热固定

珠晖区18542874048： 微生物运动性 - ？
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珠晖区18542874048： 鞭毛染色在植物病原细菌鉴定中有什么作用 - ？
尹肯强力： 鞭毛染色方法很多,但其基本原理相同,即在染色前先用媒染剂处理,让它沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然后再进行染色.常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成. 细菌鞭毛是细菌的运动器官,幽门螺杆菌能够从强酸性的胃内腔穿过胃上皮细胞上的黏液层达到胃上皮细胞的中性环境,这就是鞭毛运动作用的很好例证. 通过鞭毛染色,可以观察到鞭毛形态、数量和鞭毛在菌体分布的位置,鞭毛数量和在菌体上的分布位置是鉴定细菌的重要依据之一,根据鞭毛的这些特征,可将有动力细菌分为单端极鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌.利用细菌鞭毛染色技术,可以将有动力的细菌进行归类,特别是在细菌鉴定中具有否定作用.

珠晖区18542874048： 鞭毛染色与其他染色有什么不同为什么不同? - ？
尹肯强力：[答案] 鞭毛染色于其他染色单只染色本身是没什么区别的,只不过细菌的鞭毛非常纤细,直径一般在20nm左右,用电镜才能观察.必须经过特殊的鞭毛染色,即在染色前先经媒染剂处理,媒染剂吸附在鞭毛上,使鞭毛加粗,便可达到普通光学显...

珠晖区18542874048： 染料染色的机理各有什么? - ？
尹肯强力： 这个简单不好解释,可以到百科查看详细机理:革兰氏染色,酸性染色,碱性染色,芽孢染色,负染色,鞭毛染色等

珠晖区18542874048： 细菌鞭毛镀银染色有什么新方法? ？
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尹肯强力： 1.要选好菌种.一般用周生鞭毛菌(如普通变形杆菌Proteus vulgaris)较好,这类菌的鞭毛多而长易于观察.2.要注意培养条件和培养时间:①用点接法在新配制的牛肉膏蛋白胨半固体平板上接种.一般一个平板点接3~4处.经比较用半固体培养...

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