香草醛法测原花青素为什么会产生沉淀
作者&投稿:大叔万 (若有异议请与网页底部的电邮联系)
花色素(花青素)苷元虽为平面型结构,但因以离子形式存在,具有盐的通性,故亲水性较强,水中溶解度较大。花青素的提取多采用水煮提,加酸沉淀的方法。
研究表明,葡萄籽中原花色素物质只有原花青素 一种[21。关于原花青素的定义还不统一。原花青素因在 酸性介质中加热产生红色的花青素而得名【3】,而儿茶素 类单体在热酸条件下反应没有花色素现象,所以儿茶 素单体应不属于原花青素。这个概念也得到了美国葡 萄籽方法评定委员会和国内主要生产葡萄籽提取物的企业认可。葡萄籽原花青素是由儿茶素、表儿茶素及其 没食子酸酯通过C4-C 或C4-C。键共价相连组成的多 聚体 ,结构通式见图l【5J。通常把二~四聚体称为低聚 体(OPCs),五聚体及五聚体以上的称为高聚体。
R=3p—OH儿茶素,R=3p—O一没食子酸儿茶素O一没食子酸酯 R-3a-OH表儿茶素。R-3a-O一没食子酸表儿茶素o-没食子酸酯
1 葡萄籽原花青素的概念、性质和安全性
1.1 原花青素的概念
研究表明,葡萄籽中原花色素物质只有原花青素 一种[21。关于原花青素的定义还不统一。原花青素因在 酸性介质中加热产生红色的花青素而得名【3】,而儿茶素 类单体在热酸条件下反应没有花色素现象,所以儿茶 素单体应不属于原花青素。这个概念也得到了美国葡 萄籽方法评定委员会和国内主要生产葡萄籽提取物的企业认可。葡萄籽原花青素是由儿茶素、表儿茶素及其 没食子酸酯通过C4-C 或C4-C。键共价相连组成的多 聚体 ,结构通式见图l【5J。通常把二~四聚体称为低聚 体(OPCs),五聚体及五聚体以上的称为高聚体。
R=3p—OH儿茶素,R=3p—O一没食子酸儿茶素O一没食子酸酯 R-3a-OH表儿茶素。R-3a-O一没食子酸表儿茶素o-没食子酸酯
图1 原花青素的结构及其组成单元
1.2 原花青素的主要性质
原花青素在热酸条件下能够生成红色的花青素,此性质可用于原花青素的定性和定量分析。结构中具 有较多的羟基,具有较大的极性,使其能够很好的溶解 于水、甲醇、丙酮、乙醇等极性溶剂而不溶解于苯、氯 仿、石油醚等非极性物质。较多羟基结构也使其成为良 好的氢原子给予体,具有较强的抗氧化性质。研究表 明,在0 一、·OH、·CH,中,原花青素对0:一·清除能力最 好,而且在聚合度2~5之间范围内,随聚合度增加而增 加柳。对其构效关系分析表明,带有没食子酰基的原花青 素具有更强的抗氧化活性,二聚体的抗氧化活性均比单 体儿茶素的活性强。c 一c 连接的二聚体比c 一c 连 接的二聚体具有更强的抗氧化活性 。原花青素的最大 吸收波长在280 nm附近,使其具有较强的紫外吸收能 力。以上的主要性质使原花青素很好的用于保健食品 和化妆品的开发。
13 原花青素产品的安全性
美国Creighton大学葡萄籽原花青素研究组与美 国环境保护局根据有毒物质控制条例健康效果测试手 册协同进行了葡萄籽原花青素萃取物(GSPE)的一系 列毒性和生物功效研究。结果证明GSPE具有很高的 安全性和很好的清除自由基、抗氧化能力【8】。日本学者 Yamakoshi等也采用一系列毒理性试验确证富含原花 青素的葡萄籽提取物具有很高的安全性。完全可以用 于功能性食品的开发.
2 原花青素的提取方法
提取原花青素常用的方法有水提取法、有机溶剂一 水提取法和仪器辅助提取法。葡萄籽中的原花青素物 质通常以结合态与蛋白质、纤维素结合在一起fl01,一般 不易提出,通常选用有机溶剂或水提取,具有断裂氢键 的作用。同时由于有机溶剂的渗透性较差,一般不单独 使用,常需要水作为传质剂。
2.1 水提取法
Masquelier~l-嘬早从松树皮中用沸水粗提、乙酸乙 酯纯化得到原花青素。选水作为提取剂,浸提耗时长, 温度高,容易造成原花青素的损失。同时水的极性较 大,溶出杂质也较多。
2.2 有机溶剂一水提取法
甲醇、丙酮、乙醇和乙酸乙酯是提取葡萄籽原花青 素常用的有机溶剂,它们对原花青素有很好的溶解性, 它们的极性大II,Jt~序为甲醇>乙醇>丙酮>乙酸乙酯。 乙醇是常用的提取溶剂,价格低廉,来源丰富。乙酸乙 酯提取出的原花青素成分生物活性较好,但是由于极 性较小,对原花青素的提取并不完全。甲醇和丙酮水溶 液(50%~75%)对原花青素都有较好的提取性能,同时也多用做原花青素含量测定时的提取溶剂。熊何 -21比 较了甲醇、乙醇、丙酮水溶液对多酚的提取效果,结果 表明70%丙酮水溶液为最好溶剂。丙酮水溶液提取效 果好的原因:原花青素分子含有多个苯环和醚键,油溶 性较强,同时又有大量的羟基连接在分子骨架上,在水 中具有很好的溶解性,拥有油水双溶性的丙酮与之相 互匹配,原花青素的溶解度自然增加,其提取率相应得 到提高。
2-3 仪器辅助提取法
超临界萃取和超声波辅助提取越来越多的用于葡 萄籽原花青素的提取。超临界CO:萃取率高,而且使原 花青素不受到空气和光的影响,但由于设备昂贵,推广 使用比较困难。超声波法应用比较广泛,超声波产生的 强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌等特殊 作用,可以破坏植物的细胞壁,使溶剂渗透到细胞中, 令其中的化学成分溶于溶剂中,从而提高提取效率。 在提取原花青素之类的热敏性物质显示出优越的性 能.
3 葡萄籽原花青素的检测
由于葡萄籽和葡萄籽提取物中大多数多酚是原花 青素(一般占70%~85%),所以很多厂家使用原花青 素来标定其中有效成分的含量。原花青素含量是反映 葡萄籽提取物或葡萄籽质量的关键指标,主要有两个 指标,分别为原花青素值和原花青素含量。
3.1 原花青素值的测定
原花青素值的测定采用Bates—smith法和Poaer 法。原理:原花青素在酸性条件下加热转化为红色的花 青素,而儿茶素、表儿茶素等黄烷一3一醇单体没有此反 应(图2)。它们测出的结果是原花青素的相对含量,分 别用原花青素指数和PVU表示,是根据经验公式求得 的。葡萄籽提取物中的原花青素指数一般在80~100之 间,PVU一般在250~350之间。
原花青素值只是相对含量,并非原花青素的真实 含量。据调查,同为原花青素值95的产品,多酚含量相 差15%,质量大相径庭四。很多生产厂家使用原花青素 指数来表示葡萄籽提取物中原花青素的百分含量是错误的。
图2 花青素生成反应 Fig.2 Reaction ofproducing cyaniding
3.2 原花青素含量的测定
原花青素的含量测定方法很多,也比较混乱。常用 的有以下几种方法。
3.2.1 铁盐催化法
此方法的反应原理与原花青素值测定原理相 同,在计算原花青素的含量时使用了原花青素标准 品。Fe¨、盐酸为常用的催化剂和酸解剂。由于水、乙 醇为反应介质时吸光值很低,一般采用正丁醇为反 应介质【15-161。通常的具体操作:取1.0 mL样液(或原花 青素溶液)于10 mL刻度试管中,加入6.0 mL正丁醇一 浓盐酸(95:5)与2% 硫酸铁铵溶液(溶解于2 mol/L 盐酸)0.2mL,混匀,置于沸水浴中加热40min后,立即 取出用冰水快速冷却至室温,在550 Nm处测定吸光值。
此方法较简便,而且对原花青素的选择性反应较 好。铁盐催化法对反应体系中的含水量和Fe 浓度要求 比较严格,一般要求含水量6%,Fe 浓度4.5x10 %, 而且过高的Fe¨浓度对反应没有影响【l51。傅武胜【l61 研究表明3%~4%为合适的含水量,Fe 浓度选择在 9.OxlO %左右。但是也有学者总结分析2%~6%含 水量对花青素的形成有抑制作用,稍高的Fe¨浓度 (>15 g/L)也抑制花青素的生成.
在铁盐催化反应的基础上,杨大进【l I等人利用高 效液相色谱法检测了原花青素含量。该方法将原花青 素在上述铁盐催化条件下生成的深红色花青素离子 进行高效液相色谱分析,从而确定原花青素的含量。 此方法能够排除部分杂质的影响,具有定性定量准确 的优点。
3.2.2 香草醛法
测定原理:原花青素和儿茶素类单体的A环的化 学活性较高,在酸性条件下,其上的问苯二酚或间苯 三酚与香草醛发生缩和,产物在浓酸作用下形成红色 的正碳离子,样品的浓度与产生的颜色呈正相关,在500 llm波长下测定其吸收光值【l91(图3)
图3 酚醛缩合反应
香草醛法测定时,一般以儿茶素为标准物,以甲醇为溶剂。盐酸、硫酸均可作为反应过程的催化剂,但在 使用硫酸时,浓度不易过高,过高的硫酸易使香草 醛发生自缩合反应和氧化分解 。具体的操作方式 较多:1 mL试液+2.5 mL 1%香草醛甲醇溶液+2.5 mL 25%硫酸或8%盐酸(均溶解于甲醇),30。【二下反应 15 min~20 min【2l。丑 ;1 mL试液+6 mL 4%香草醛甲醇 溶液+3 mL浓盐酸,室温下反应15 minL231;有的更是在 2O℃下反应15 h[241。操作方式差别较大,不利于使用 者的选择,有待于统一。
3.2_3 紫外分光光度法
原花青素为无色物质,在可见光区无特征吸收峰, 在紫外区有唯一特征吸收峰,最大吸收波长在280 Nm 处。尽管此方法简单快捷,但是此方法只适用于原花青 素含量纯度特别高的产品,不适合一般原料中原花青 素的检测。这是因为儿茶素类在280 Nm处也有最大吸 收,V 、Vc、Ve。、Ve 、芦丁、B一胡萝卜素等物质在此波长 处都有明显的吸收.
3.2.4 Folin—Ciocaheau与HPLC结合法
此方法为美国葡萄籽方法评定委员会推荐使用的 方法。Folin—Ciocaheau法测定的是多酚含量,一般以没 食子酸为对照物。在碱性溶液中,多酚可以将钨钼酸还 原,生成蓝色的化合物,在760 Nm处有最大吸收。葡萄 籽提取物中的多酚含量一般在75%~95%之间。利用 HPLC测定没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没 食子酸酯四种单体的含量来代表单体的总量。这是因 为它们四种单体的含量占到了葡萄籽提取物中单体含 量的90.0%以上。原花青素的含量则为多酚含量与单 体含量相减之差。
此方法缺点是蛋白质、氨基酸、核酸、抗坏血酸等 易被氧化的物质也参与Folin—Ciocalteau反应。同时由 于葡萄籽提取物中没食子酸含量甚微(0%~1.2%),与 儿茶素(1.5%~7.3%)和表儿茶素(2.0%~5.1%)含量 相差悬殊四,原花青素含量用没食子酸量来表示缺乏 代表性。
3.2.5 钼酸铵分光光度法
它是基于邻苯二酚与钼酸铵在弱酸性介质中生成 黄色钼酸酯,反应产物在333 nm波长处具有最大吸收。 马亚军 寸检测条件进行了简单摸索:取0.08 mol,L钼 酸铵1 mL溶液置于25mL比色管,加人适量试液,用 1.OxlO mol/L盐酸冲至刻度,反应瞬间完成。
根据反应原理,花色素、没食子酸、儿茶素类都具 有邻苯二酚结构,也参与钼酸酯的生成,测定原花青素 的选择性不高,受到杂质影响较大。
3.2.6 其它测定方法
马亚军 对原花青素含量测定方法进行了研究: 高铁盐一铁氰化钾分光光度法,它是基于原花青素能将 Fe 还原成Fe ,Fe 与铁氰化钾生成可溶性深蓝色配 位化合物,在710 nm处有最大吸收的原理;硫酸高铈 铵分光光度法,它是基于原花青素与Ce“在强酸性介 质中反应生成无色的Ce ,Ce“在319 nm波长处具有 最大吸收,通过测定黄色高铈盐的吸光度,间接测定原 花青素。另外还有流动注射一抑制化学发光法[271:在碱 性条件下,利用原花青素还原H:O:可抑制鲁米诺一 H20 体系的化学发光,其抑制的程度与原花青素浓度 之间呈线性关系。这三种方法如同Folin—Ciocaheau法 利用多酚的还原性质测定多酚含量的原理,结果都扩 大了原花青素的含量。
综上所述,原花青素值的测定只是根据经验公式, 并不是原花青素真实含量,与现代检测方法相落伍。铁 盐催化法测定原花青素专属性较强,有很好的应用前 景,但仍需要进一步的研究与改进。香草醛法测定的是 原花青素和黄烷一3一醇单体的总量,与HPLC法检测黄 烷一3一醇单体:儿茶素、表儿茶素含量相结合起来可以 计算原花青素的含量。但是香草醛法操作方式较多,不 利于使用者选择,具体操作方法还需要进行统一。国外 有学者利用HPLC/MS技术分析和检测原花青素,过程 比较复杂,技术要求高,不能广泛应用于原花青素产品 的测定。
4 展望
葡萄籽原花青素拥有高效的抗衰老、抗心血管疾 病、抗癌功能,此外还具有抗辐射、抗疲劳,改善记忆力 等作用,显示出了无比的优越生物活性和安全性。目前 我国生产和销售葡萄籽提取物就有50多家,年生产能 力超过80 t。因此,为了与葡萄籽提取物行业的蓬勃发 展相适应,迫切需要建立起统一的葡萄籽及其产品中 原花青素含量的测定方法,以利于企业的生产贸易、产 品的质量控制和顾客的消费指导。
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