DNA的粗提取与鉴定中各种试剂的作用
把实验贴给你，自己分析吧
【实验十二】DNA的粗提取与鉴定
[日期：2007-12-14] 来源：桂林中学校园网 作者：毛敏 [字体：大 中 小]
【实验十二】DNA的粗提取与鉴定
实验原理
DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氧化钠的浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为 0．14 mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。
DNA不溶于95%的酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
DNA中含有脱氧核糖，能与二苯胺（沸水浴）反应生成蓝色物质，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
目的要求
1. 学会DNA的粗提取和鉴定的方法。
2. 观察提取出来的DNA物质的颜色和形状。
材料用具
材料：活鸡或鲜血鸡血。
仪器：离心机、恒温水裕锅、载玻片，玻璃棒，滤纸，滴管，量简（100 mL，l个），烧杯（100 mL，l个，50 mL、500 mL各 2个），试管（20 mL，2个），漏斗，试管夹，纱布。
试剂：酒精的体积分数为95％的溶液（实验前置于冰箱内冷却24 h），蒸馏水，柠檬酸钠的质量浓度为 0．1g／mL的溶液，氯化钠的物质的量浓度分别为 2 mol／L和0．015 mol/L的溶液，二苯胺试剂。
方法步骤
实验前需要制备鸡血细胞液（由教师完成），制备的方法是：取柠檬酸钠的质量浓度为 0．1 g／mL的溶液（抗凝剂）100 mL，置于500 mL烧杯中。将宰杀活鸡流出的鸡血（约180 mL）注入烧杯中，同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血。然后，将血液倒入离心管内，用 1000 r／min的离心机离。2min，此时血细胞沉淀于离心管底部。实验时，用吸管除去离。心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。
1．提取鸡血细胞的细胞核物质
将制备好的鸡血细胞液5 mL～10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。
2．溶解细胞核内的DNA
将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶液40mL加入到滤液中，并摇动烧杯，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。
3．析出含DNA的粘稠物
沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 mol／L）。
4．滤取含DNA的粘稠物
用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上。
5．将DNA的粘稠物再溶解
取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。
6．过滤含有DNA的氯化钠溶液
取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中。
7．提取含杂质较少的DNA
在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为 95％的溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA 。注意观察丝状物是什么颜色的。
8．DNA的鉴定
取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0．015 mol／L的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。将观察的结果填写在《实验报告册》上。
结论
步骤8的2支试管中溶液颜色的变化说明了什么？将得出的结论填写在《实验报告册》上。
1.鸡血细胞液；预冷的95%的酒精溶液；蒸馏水；质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液；物质的量浓度分别为2 mol/L 和0.015 mol/L的氯化钠溶液；二苯胺试剂。2.（1）应用低渗原理和机械搅拌使细胞破裂并过滤。本步骤直接决定提取的核物质的多少及实验结果。（2）溶解细胞核内DNA。加2 mol/L的NaCl溶液并用玻棒搅拌。（3）析出DNA黏稠物并过滤。注意①注蒸馏水要慢，防过量而使DNA重新溶解（把握浓度达0.14 mol/L）。②轻轻沿同一方向搅拌，有利于DNA析出、附着、缠绕。（4）再溶解DNA黏稠物并过滤。用浓度为2 mol/L的NaCl溶液。（5）提取含杂质较少的DNA。用预冷的95%的酒精。因其①可抑制核酸水解酶活性，防止降解。②降低分子运动，易析出沉淀。③低温利于增加DNA柔韧性，减少断裂3．DNA鉴定。用二苯胺在沸水浴中与DNA作用出现蓝色。
浓度较高的氯化钠溶液(大概物质的量浓度为2 moL/L )中,核蛋白容易解聚,游离出DNA。而DNA在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高,Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈溶解状态。加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说,是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂。
利用DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水,稀释氯化钠溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白质的溶解度增高从而使二者分离。
将含有Na+的DNA溶液,加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中,混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩,形成含杂质较少的DNA丝状物,悬浮于溶液中。
鉴定 甲基绿
甲基绿见DNA会给它染上绿色
就可以鉴定出是DNA
DNA鉴定。用二苯胺在沸水浴中与DNA作用出现蓝色。
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