DNA的粗提取与鉴定中各种试剂的作用
把实验贴给你,自己分析吧
【实验十二】DNA的粗提取与鉴定
[日期:2007-12-14] 来源:桂林中学校园网 作者:毛敏 [字体:大 中 小]
【实验十二】DNA的粗提取与鉴定
实验原理
DNA在氯化钠溶液中的溶解度,是随着氧化钠的浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol/L时,DNA的溶解度最大,浓度为 0.14 mol/L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理,可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。
DNA不溶于95%的酒精溶液,但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
DNA中含有脱氧核糖,能与二苯胺(沸水浴)反应生成蓝色物质,因此,二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
目的要求
1. 学会DNA的粗提取和鉴定的方法。
2. 观察提取出来的DNA物质的颜色和形状。
材料用具
材料:活鸡或鲜血鸡血。
仪器:离心机、恒温水裕锅、载玻片,玻璃棒,滤纸,滴管,量简(100 mL,l个),烧杯(100 mL,l个,50 mL、500 mL各 2个),试管(20 mL,2个),漏斗,试管夹,纱布。
试剂:酒精的体积分数为95%的溶液(实验前置于冰箱内冷却24 h),蒸馏水,柠檬酸钠的质量浓度为 0.1g/mL的溶液,氯化钠的物质的量浓度分别为 2 mol/L和0.015 mol/L的溶液,二苯胺试剂。
方法步骤
实验前需要制备鸡血细胞液(由教师完成),制备的方法是:取柠檬酸钠的质量浓度为 0.1 g/mL的溶液(抗凝剂)100 mL,置于500 mL烧杯中。将宰杀活鸡流出的鸡血(约180 mL)注入烧杯中,同时用玻璃棒搅拌,使血液与柠檬酸钠溶液充分混合,以免凝血。然后,将血液倒入离心管内,用 1000 r/min的离心机离。2min,此时血细胞沉淀于离心管底部。实验时,用吸管除去离。心管上部的澄清液,就可以得到鸡血细胞液。
1.提取鸡血细胞的细胞核物质
将制备好的鸡血细胞液5 mL~10mL,注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL,同时用玻璃棒充分搅拌5 min,使血细胞加速破裂。然后,用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。
2.溶解细胞核内的DNA
将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶液40mL加入到滤液中,并摇动烧杯,使其混合均匀,这时DNA在溶液中呈溶解状态。
3.析出含DNA的粘稠物
沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水,同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌,这时烧杯中有丝状物出现,注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水,溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水(这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 mol/L)。
4.滤取含DNA的粘稠物
用放有多层纱布的漏斗,过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中,含 DNA的粘稠物被留在纱布上。
5.将DNA的粘稠物再溶解
取 1个 50 mL烧杯,向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 mol/L的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中,用玻璃择不停地搅拌,使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。
6.过滤含有DNA的氯化钠溶液
取1个100 mL烧杯,用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液,DNA溶于滤液中。
7.提取含杂质较少的DNA
在上述滤过的溶液中,加入冷却的、酒精的体积分数为 95%的溶液 50mL(使用冷却的酒精,对DNA的凝集效果较佳),并用玻璃棒搅拌,溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起,并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA 。注意观察丝状物是什么颜色的。
8.DNA的鉴定
取两支20 mL的试管,各加入氯化钠的物质的量浓度为0.015 mol/L的溶液5 mL,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热 5 min,待试管冷却后,观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。将观察的结果填写在《实验报告册》上。
结论
步骤8的2支试管中溶液颜色的变化说明了什么?将得出的结论填写在《实验报告册》上。
1.鸡血细胞液;预冷的95%的酒精溶液;蒸馏水;质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液;物质的量浓度分别为2 mol/L 和0.015 mol/L的氯化钠溶液;二苯胺试剂。2.(1)应用低渗原理和机械搅拌使细胞破裂并过滤。本步骤直接决定提取的核物质的多少及实验结果。(2)溶解细胞核内DNA。加2 mol/L的NaCl溶液并用玻棒搅拌。(3)析出DNA黏稠物并过滤。注意①注蒸馏水要慢,防过量而使DNA重新溶解(把握浓度达0.14 mol/L)。②轻轻沿同一方向搅拌,有利于DNA析出、附着、缠绕。(4)再溶解DNA黏稠物并过滤。用浓度为2 mol/L的NaCl溶液。(5)提取含杂质较少的DNA。用预冷的95%的酒精。因其①可抑制核酸水解酶活性,防止降解。②降低分子运动,易析出沉淀。③低温利于增加DNA柔韧性,减少断裂3.DNA鉴定。用二苯胺在沸水浴中与DNA作用出现蓝色。
浓度较高的氯化钠溶液(大概物质的量浓度为2 moL/L )中,核蛋白容易解聚,游离出DNA。而DNA在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高,Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈溶解状态。加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说,是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂。
利用DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水,稀释氯化钠溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白质的溶解度增高从而使二者分离。
将含有Na+的DNA溶液,加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中,混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩,形成含杂质较少的DNA丝状物,悬浮于溶液中。
鉴定 甲基绿
甲基绿见DNA会给它染上绿色
就可以鉴定出是DNA
DNA鉴定。用二苯胺在沸水浴中与DNA作用出现蓝色。
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