质谱流式细胞技术简介
质谱流式细胞技术(mass cytometry,MC)就是将电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)应用到单个细胞的分析,原理是用纯化的单元素同位素标记抗体,然后使用ICP-MS检测该元素离子峰。该技术融合了流式细胞分选仪和ICP-MS。操作流程简单,如图1所示,首先细胞用带有金属元素(一般是镧系金属)的特异性抗体标记3-4,然后被送入质谱流式细胞仪,细胞以单个细胞液滴状态被雾化后进入高温等离子体,产生自由原子,四级杆选择只通过镧系金属质量范围内的离子,去除其余离子,利用飞行时间质谱(TOF mass spectrometry)检测镧系金属离子的相对信号强度。质谱流式细胞仪由多伦多大学的研究人员首先研发出来,第一台商品化的质谱流式细胞仪名为Cytometry by Time-Of-Flight (CyTOF),相关抗体试剂由DVS Sciences公司生产和销售。
传统流式细胞术用荧光基团作为报告分子,通过对发射光强度定量以确定目标分子的表达量,但荧光基团发射谱常有重合,尤其是在同一个实验中进行多参数测量的情况下,难以区分多个荧光基团。质谱流式细胞技术使用单一分子量的稳定镧系金属代替荧光基团作为报告分子,元素质谱分析仪能够通过分子量准确区分不同原子质量,并且不同镧系金属质量没有信号重叠,增加了定量的准确性。
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目前,质谱流式细胞技术可以同时对51个靶蛋白进行检测,每秒检测1000个细胞,平均每天可检测100个样品,最低检测限为100个拷贝分子,已经过验证的镧系金属标记抗体种类超过400种;除常规蛋白外,质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰1,蛋白降解产物5,检测细胞存活率,细胞大小,mRNA转录子表达量6,DNA合成速率7以及蛋白酶活性8等的测定。
正如蛋白质组学中的非标记定量,质谱流式细胞技术对靶点的定量准确性也受到不同仪器离子化效率的差异、仪器状态等的影响;同时,传统的质谱流式细胞技术每次只能检测一个样品,通量较低。因此, 质量标签细胞条码技术(mass-tag cellular barcoding,MCB) 应运而生。
细胞经过药物等处理后,用多聚甲醛固定后,使用MCB试剂对不同样本的细胞进行条形码标记,然后将不同样本混合后进行常规质谱流式细胞分析前处理和检测。最终通过检测条形码对应的元素离子,对细胞进行样品归类。
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图2. 多路质谱流式细胞技术
多路质谱流式细胞技术实验步骤如图2所示,不同处理的样本经过甲醛固定,使用不同mDOTA分子对不同样本进行标记,然后进行常规的质谱流式细胞分析的前处理和检测。
这里使用的mDOTA分子是一个双功能化合物,一端可以螯合金属离子,一端则可以和细胞中蛋白上的自由巯基以共价键形式结合(如图3所示),一个mDOTA分子可以螯合一个镧系金属元素原子,那为什么叫barcode呢? Barcode 就是指可以同时添加多种被镧系金属元素螯合的mDOTA分子,在CyTOF中共价键被打碎后,每种镧系金属元素的峰即可形成有和无两种情况,使用的镧系金属元素螯合的mDOTA试剂的种类越多,最终可组成的条形码种类越多,如图4所示,使用7种镧系金属元素螯合mDOTA试剂,可以组成2的7次方种条形码,即可以同时标记128个样品。 MCB的使用,可以对多个样本同时进行单细胞定量分析,增加了质谱流式细胞分析技术的分析通量,并且增加了相对定量的准确性。 本文一开始提到的那篇Cell Stem Cell的文章,就是利用MCB技术,在单细胞层面研究人源红细胞生成过程中内源转录因子的表达和调控。
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图3. mDOTA分子反应原理
细胞使用双功能分子mDOTA(maleimido-mono-amide- DOTA)以共价键形式进行标记。mDOTA一端可以螯合稀土元素,一端可以和细胞内的蛋白的巯基反应。
但是MCB存在一定的缺陷,首先在每次仪器校正后,质谱流式细胞仪的离子检测灵敏度都会发生变化,尽管可以用内参进行校正,将样品混合后检测会降低样品之间的变化程度; 其次,MCB使用镧系金属元素和后期使用的抗体耦连的镧系金属不能相同,因此MCB的使用缩小了后续标记抗体的选择范围。 因此,后来基于钯元素的MCB试剂被进一步发展出来11。 使用钯元素的6个同位素原子进行MCB分子的构建有以下两点优势: 首先,钯元素因为和标记抗体的试剂(Diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA)-based polymer)不兼容,抗体标记不会使用钯元素,因此MCB分子使用钯元素不会干扰后续标记抗体的选择; 第二,Pd有6个稳定同位素,102, 104, 105, 106, 108和110 amu, 纯度很高,分别为91%, 96%, 98%, 99%, 99%和99%,这些同位素和其他镧系金属元素质量相差甚远,不会影响后续的抗体耦连的镧系金属元素的检测。
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图4. MCB形成原理
使用七种镧系金属元素螯合mDOTA试剂,按图中分布添加mDOTA试剂,可以组成2的7次方种条形码,即可以同时标记128个样品。
最后我们简单说一下这个技术的优缺点。优点是可同时检测的通道比较多,现在可以做到同时检测51个目标蛋白;可操作性强,试剂都是商品化的;速度虽然比不上流式细胞仪(每秒10000个细胞),但也并不慢,每秒可检测1000个细胞;成本低,平均每个细胞测量成本仅需0.005美分,对比单细胞测序技术每个细胞平均22美元,可以说是相当便宜了。
当然,就目前来看,这个技术还存在不少的不足之处。 首先,细胞在分析中被雾化并离子化,在分析后不能保留完整的活细胞状态; 其次,灵敏度低于荧光基团,不能检测极低水平表达的分子,检测的动态范围最多只能达到3-4倍,而荧光基团的检测范围则可到50倍左右;第三,不同仪器之间的离子化效率不同,需要通过掺入聚苯乙烯珠子进行信号强度的校正,实现同一个仪器的数据的比较; 第四,和基于荧光基团的流式细胞技术一样,质谱流式细胞技术仍然不能检测小分子代谢产物,并且不能对一个细胞进行连续的动态监测; 最后,也是最重要的一点,不能对蛋白组中的所有蛋白进行监测,只能对特定目标蛋白进行检测,因此需要更为严谨的实验设计。
不管怎样,质谱流式细胞技术还在不断地发展和改进,我们能利用这个技术解决的问题也越来越多。希望通过这次对质谱流式细胞技术的系统性介绍,也能为大家目前面临的问题提供一点新思路,为大家的课题添砖加瓦。(来源清华大学蛋白质研究技术中心蛋白质化学与组学平台)
参考文献:
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3. Lou, X. D.; Zhang, G. H.; Herrera, I.; Kinach, R.; Ornatsky, O.; Baranov, V.; Nitz, M.; Winnik, M. A., Polymer-based elemental tags for sensitive Bioassays. Angew Chem Int Edit 2007, 46 (32), 6111-6114.
4. Majonis, D.; Herrera, I.; Ornatsky, O.; Schulze, M.; Lou, X. D.; Soleimani, M.; Nitz, M.; Winnik, M. A., Synthesis of a Functional Metal-Chelating Polymer and Steps toward Quantitative Mass Cytometry Bioassays. Anal Chem 2010, 82 (21), 8961-8969.
5. Bjornson, Z. B.; Nolan, G. P.; Fantl, W. J., Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Curr Opin Immunol 2013, 25 (4), 484-494.
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7. Behbehani, G. K.; Bendall, S. C.; Clutter, M. R.; Fantl, W. J.; Nolan, G. P., Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytom Part A 2012, 81a (7), 552-566.
8. Edgar, L. J.; Vellanki, R. N.; Halupa, A.; Hedley, D.; Wouters, B. G.; Nitz, M., Identification of Hypoxic Cells Using an Organotellurium Tag Compatible with Mass Cytometry. Angew Chem Int Edit 2014, 53 (43), 11473-11477.
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11. Zunder, E. R.; Finck, R.; Behbehani, G. K.; Amir, E. D.; Krishnaswamy, S.; Gonzalez, V. D.; Lorang, C. G.; Bjornson, Z.; Spitzer, M. H.; Bodenmiller, B.; Fantl, W. J.; Pe'er, D.; Nolan, G. P., Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc 2015, 10 (2), 316-333.
流式细胞术的应用范围
可用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定,以及免疫学研究,并已开始用于细菌鉴定,病毒感染细胞的识别和艾滋病感染者T4、T8细胞的记数。自70年代以来,随着流式细胞技术水平的不断提高,其应用范围也日益广泛。流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础...
年终盘点 | 影响因子超350分,2021年质谱流式高分文章集锦
本研究通过对SARS-CoV-2沉默感染阶段(silent SARS-CoV-2 infection stage, SSIS)的队列研究,通过整合质谱流式细胞技术(CyTOF)、转录组测序(RNA-seq)和血浆微量蛋白的Olink检测技术,分别从从单细胞蛋白质组、转录组和血浆蛋白质组三个维度阐释区分持续无症状感染者和潜伏期无症状感染者的主要免疫学差异。研究发现潜...
实用流式细胞术彩色图谱内容介绍
接着,对生物样品的制备步骤、检测方法和分析流程进行了简要讲解,以便于读者掌握核心操作。此外,还深入介绍了流式细胞术中常见的生物学指标的正常参考值,帮助读者理解其临床应用价值。图谱部分则更为直观,分为21个专题,涵盖了广泛的细胞学内容。包括实验条件设定、细胞组成(DNA、RNA和蛋白质含量)的...
利用质谱技术进行临床癌症蛋白质组学研究
此外,肿瘤异质性问题对单细胞水平的蛋白质研究提出了要求。基于质谱的质谱流式技术可以在单个细胞中监测几十个蛋白质标志物,将抗体探针和独特的重金属同位素连接在一起后与细胞孵育,然后细胞被感应耦合等离子体(ICP)雾化,金属离子向质谱仪提供目标蛋白在样本中的定量读数。 2019年10月在《Cell》上发表的“Integrated ...
流式细胞术
童鞋你这是个100分问题啊亲。。。BD Accuri C6 我没有用过,我找到的laser和filter信息如下,假定你用的是标准配置(红框内)你挑选的4个荧光已经分布到4个不同的通道,貌似可以共染色然后同时读取。 具体有一些特别注意的地方分析如下:1。efluor660的发射光谱同670LP filter的波段有严重重叠但是因为...
当质谱流式撞见免疫代谢
pERK和NRF1 等。5.小结 质谱流式细胞技术结合质谱技术和传统光谱流式细胞技术,大大增多了可检测的参数,并无需补偿,弥补了荧光流式技术上的不足。不过,质谱流式吞吐量小、细胞利用率低、金属同位素灵敏性较低等的不足是质谱流式未来需要客服的缺点。尽管如此,质谱流式拥有强大的单细胞水平分辨率,...
在流式细胞中什么是光谱交叉
准确的说应该叫重叠。先上个图 上面图中,每个颜色的曲线峰都代表一个不同的荧光素的光谱。在流式细胞仪的检测器(PMT)前面,都安装有滤镜对可检测的光谱起到限制作用。这个图上每个检测器前方的滤镜可通过波长就用相对颜色的柱形图来标示。基本上都是位于每个峰的中央。你在图中可以看到。尽管滤镜...
膜蛋白是什么?膜蛋白检测技术有哪些?
常见的膜蛋白检测技术包括:免疫印迹法(Western blot):利用特异性抗体与膜蛋白结合,通过电泳等方法将膜蛋白分离并检测其分子量、表达量等信息。免疫组化法(Immunohistochemistry):在细胞组织中检测膜蛋白的表达情况,利用特异性抗体标记膜蛋白,并在显微镜下观察免疫反应信号。流式细胞术(Flow cytometry...
在流式免疫技术中,fitc常用的激发波长和发射波长分别是().
发射波长的解释:发射波长是指荧光物质在受到激发后,电子回到基态时释放出的荧光光的波长。FITC的发射光谱的最大值大约在525nm处,因此,通过检测这一波长的荧光强度,可以间接检测目标抗原或抗体的表达水平。在流式细胞仪中,通过设定特定的激发和发射波长,可以实现对标记了FITC的细胞的特异性检测。这种...
文献解读 | 单细胞测序揭示早期人类胚胎骨骼干细胞起源
【应用技术】 10x Genomics单细胞转录组测序;研究流程 骨骼的发生发育在小鼠、小鸡和蝾螈等生物中已经得到了广泛的研究,而人类的研究主要停留在组织形态学水平。本研究首先对孕5周人类胚胎肢芽和孕8周人类胚胎长骨进行高通量单细胞转录组测序,分别分析肢芽和长骨的发育谱系,然后再结合流式细胞术等实验鉴定胚胎骨骼祖...
用品回生: 质谱流式细胞技术(Mass Cytometry)是利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术.它继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点,又具有质谱检测的高分辨能力,是流式细胞技术一个新的发展方向. 详情请见 http://baike.baidu.com/view/10897576.htm#4
华莹市15967262768: 什么是流式细胞术 - ?
用品回生: 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段,它可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,与传统的荧光镜检查相比,具有速度快、精度高、准确性好等优点,成为当代最先进的细胞定量分析技术.
华莹市15967262768: 质谱流式细胞技术都可以测量哪些参数 - ?
用品回生: 简单的说,只要能标记到抗体上的金属同位素,都可以通过质谱的形式分辨出来.所以可以同时检测很多目标.所谓的参数,就是那些金属元素的分子量.一次可以检测几十个目标.
华莹市15967262768: 流氏细胞术是什么 - ?
用品回生: 把细胞吸到仪器中单列通过一个激光射线,射线感应器可以收集光的折射反射等数据.通过这些数据可以分析出细胞有多大,细胞内结构是否复杂,等.如果需要识别某种特别的细胞,可以通过荧光抗体或者染色来标记特定细胞,然后专门分析特定的那些细胞.流式细胞术还可以用来分离纯化特定细胞,原理和以上一样,只不过是把分析过的特定细胞搜集在一个培养容器里.
华莹市15967262768: 流式细胞术的原理在哪些检验仪器或技术平台中还有应用 - ?
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华莹市15967262768: 流式细胞仪的原理和操作过程 - ?
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华莹市15967262768: 流式细胞仪怎么用? - ?
用品回生: 流式细胞仪的结构 流式细胞仪是进行流式细胞分析的仪器,集电子、计算机、激光、流体理论于一体,被誉为试验室的“CT”.流式细胞术(Flow CytoMeter, FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手...
华莹市15967262768: 流式细胞分析 - ?
用品回生: 流式细胞分析是通过分析仪来看的,具体如下:(一)单参数直方图单参数直方图是一维数据用得最多的图形显示形式,既可用于定性分析,又可用于定量分析,形同一般X-Y平面描图仪给出的曲线.根据选择放大器类型不同,横坐标可以是线...