小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的培养
尽管DC存在于多种体内组织中，但其含量有限，无法满足科学研究和临床治疗的需要。因此，人们尝试多种方法在体外培养和扩增DC。对于人类，最常用的方法是从外周血单个核细胞（PBMC）诱导DC的产生。而对于小鼠，最常见的是从骨髓细胞诱导产生DC，即骨髓来源的DC（Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC）。
本文将重点介绍三种经典的BMDC培养法：改良的Inaba法、Son法和Lutz法，以及BMDC的大量制备法和注意事项。
**【经典的BMDC培养法】-Inaba法（改良）**
- **背景**：改良的Inaba法能获得的BMDC数量为5-7×10^6个/小鼠，操作简化，无需预处理骨髓细胞中的淋巴细胞等，仅使用GM-CSF诱导BMDC产生。然而，GM+IL-4联合诱导的DC成熟度更优，因此改良法多采用GM+IL-4共同诱导。
- **培养步骤**：首先从小鼠（6-10周龄）颈椎脱臼处死，获取骨髓细胞，通过一系列的处理获得纯净的骨髓细胞悬液。随后，用含10% FBS的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度，铺至24孔板内，加入重组小鼠GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（10ng/ml），在37℃、5% CO2的培养箱中培养。每2天更换新鲜培养液，并补足细胞因子。在第5天和第8天之间轻轻吹打培养液，收集悬浮细胞及贴壁生长的细胞，进行离心和重悬，最终获得较成熟的BMDC。
**【BMDC大量制备法】-Son法**
- **背景**：Son法可在7天内获得30-40×10^6个DC/小鼠，纯度可达85-95%。DC的内吞能力弱于Inaba经典方法，但分泌的IL-12p70量相似。在混合淋巴细胞反应中，Son法呈现更强的刺激能力，且能引起更强的特异性T细胞反应。
- **培养步骤**：与Inaba改良法类似，从小鼠骨髓细胞获取开始，调整细胞浓度为2×10^5/ml，铺至6孔板内，加入重组小鼠GM-CSF（1000U/ml）和IL-4（1000U/ml），在37℃、5% CO2的培养箱中培养。在第4天补充重组小鼠GM-CSF和IL-4，第7天收集DC，使用14.5%甲泛葡胺进行离心，获得不完全成熟的BMDC。随后用RPMI 1640完全培养液洗3次，准备进一步成熟。
**【BMDC大量制备法】-Lutz法**
- **背景**：Lutz法与Son法相似，能够大量制备BMDC，且纯度可达90-95%。使用GM-CSF作为唯一诱导剂，且培养时间较长（10-12天），可以提高最终获得的BMDC纯度。这种方法使用细菌培养皿而非细胞培养板，减少巨噬细胞对DC成熟的影响。
- **培养步骤**：从小鼠骨髓细胞获取开始，调整细胞浓度为2×10^5/ml，铺至100mm细菌培养皿中，加入重组小鼠GM-CSF（200U/ml），在37℃、5% CO2的培养箱中培养。在第3天补充重组小鼠GM-CSF，第6天和第8天分别半量换液。第10天收集细胞，即为BMDC。
**【BMDC的鉴定】**
- **形态学观察**：BMDC多呈集落生长，细胞具有多个树突样突起，成熟BMDC更为明显。
- **细胞表型分析**：使用流式细胞术检测DC细胞表面CD11c、CD40、CD80、CD86、MHCII类分子等表达，BMDC高表达这些分子，完全成熟的BMDC中这些分子的表达会进一步提高。
- **混合淋巴细胞反应（MLR）**：BMDC具有较强的刺激能力，且成熟度越高，刺激能力越强。
**【注意事项】**
- **小鼠品系和性别**：多数研究认为，小鼠品系对获得BMDC的数量和成熟度影响不大，但C57BL/6小鼠可能更好。Lutz实验中发现C57BL/6小鼠的BMDC产量最高，且ICR小鼠和C57BL/6小鼠对LPS的成熟诱导敏感度高于BALB/c小鼠。多数学者更倾向于使用雌性或雄性C57BL/6小鼠。
- **单独使用GM-CSF还是联合使用IL-4**：研究显示，GM-CSF+IL-4联合诱导产生的BMDC比单独使用GM-CSF诱导的BMDC成熟度更高，抗原递呈能力更强。因此，联合使用GM-CSF和IL-4是获得功能更好的BMDC的推荐方法。
- **成熟诱导剂的选择**：LPS、CD40L和TNF-α都是常用的DC成熟诱导剂。LPS和CD40L在诱导DC成熟方面效果相似，但诱导产生的细胞因子谱不同。CD40L诱导的成熟BMDC在体内显示出最强的免疫调节能力。对于LPS和CD40L的使用，通常推荐使用1μg/ml的LPS或重组的CD40L三聚体蛋白。
**【BMDC相关试剂推荐】**
- 在进行DC鉴定时，表面标志物的流式图上呈现单个峰，多数情况下无法完全与阴性峰区分开。为避免多色分析时补偿调节不准确导致结果的不准确性，建议使用单标或最多双标进行分析，并使用同型对照来排除背景染色。
T细胞到底有没有呈递作用
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再生障碍性贫血发病机制是什么?
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请问外周血淋巴细胞和外周体淋巴细胞有什么区别呢?跪求专业人士回答>...
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怎么明确诊断是否有巨细胞病毒
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张雁云的人物简介
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如何加强炎症在肿瘤发病发展中作用?
调节性T细胞(Tregs)具有免疫抑制功能,在肿瘤组织中聚集,在炎症反应中,这些细胞也被树突状细胞募集和激活。 骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)亦属于促炎细胞,它被炎症反应激活,并向特定部位聚集,促进血管形成,同时它也具有免疫抑制作用。因此,肿瘤相关性炎症通过产生促炎和抗炎信号,导致肿瘤生长并逃避免疫监视。 3、炎症...
查砖聚磺： 树突状细胞的特点: 1、胞浆有许多长突起呈触须状,使整个细胞的形态象一个蜘蛛. 2、树突状细胞分散于全身的上皮组织和实质性器官,其细胞数量不超过局部细胞总数的1%;也可迁移到血液和淋巴,其数量不超过血液有核细胞总数的0....
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林芝地区13733795817： 树突状细胞的分布 - ？
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林芝地区13733795817： 树突细胞的介绍 - ？
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