胚胎如何冷冻保存？
三步平衡法
（1）10%甘油保存液的配制
取9毫升20%羊血清的PBS，加入1毫升甘油，用吸管反复混合15～20次，经0.22微米滤器过滤到灭菌器内待用。
（2）取含20%羊血清0.3摩尔蔗糖的PBS 2毫升和3.5毫升，分别加入10%甘油3毫升和1.5毫升，配成含6%和3%甘油的蔗糖冷冻液。将3%、6%和10%三种甘油浓度的冷冻液分别装入小培养皿。
（3）胚胎分别在3%、6%和10%甘油的冷冻液中浸5分钟。
（4）胚胎装管
用0.25毫升塑料细管按以下顺序吸入，少量的10%甘油的PBS液、气泡、10%甘油的PBS液（含有胚胎）、气泡、少量的10%甘油的PBS液，加热封口两道（图9-18）。
图9-18 胚胎装管示意图
（5）塑料细管的编号
剪一段（2厘米）0.5毫升塑料细管作为标记外套，内装色纸，注明供体品种、耳号、胚胎发育阶段及等级、制作日期（年、月、日），并在外套管上写明序号备查。
（6）冷冻程序
将细管直接浸入冷冻仪的酒精浴槽内，以1℃/分钟的速度从室温降至-6℃，停5分钟后植冰，再停留10分钟，以0.3℃/分钟的速度降至-36℃，再以0.1℃/分钟的速度降至-38℃，直接投入液氮，长期保存。
（7）冷冻胚胎的解冻
①解冻液的配制 根据上文所述配制出10%、6%和3%甘油的蔗糖解冻液，用0.22微米过滤器灭菌，分装在小培养皿内，第1～4杯分别为10%、6%、3%、0%甘油的蔗糖解冻液，第5杯为PBS保存液。
②胚胎的解冻 胚胎从液氮中取出，在3秒钟内投入38℃水浴，浸10秒钟。
③三步脱甘油 用70%酒精棉球擦拭塑料细管和剪刀刃，剪去棉塞端，与带有空气的1毫升注射器连接。再剪去细管的另一端，在室温下将胚胎推入10%甘油和0.3摩尔蔗糖的PBS解冻液中，放置5分钟后依次移入6%、3%和0%甘油的蔗糖PBS解冻液中，各停留5分钟，最后移至PBS保存液中镜检待用。
在 丁香园（ http://dxy.ac.cn ） 找到：
关键词：胚胎冷冻；转基因小鼠；胚胎移植
随着生物工程技术的发展．出现了许多生物工程小鼠品系．促使胚胎冷冻技术得到了广泛应用。胚胎冷冻技术不仅为转基因动物提供可用胚胎．还使胚胎移植不受时间、地域限制。简化引种过程．防止疾病传播。为建立优良动物的胚胎库提供了条件。综述了几种常用的胚胎冷冻方法及其在转基因小鼠中的应用研究．指出了胚胎冷冻方法存在的主要问题，并展望了其发展
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2008-5-1 21:41
胚胎冷冻技术是一种简单、实用、经济而可靠的保种方法，它能降低动物饲养和繁育成本，扩大动物品系的保存能力，也可随时为其它胚胎工程技术如胚胎移植、胚胎分割、体外受精、动物性别控制、转基因动物技术和胚胎干细胞技术等提供可用胚胎。通过建立胚胎库，可以在世界范围内运送胚胎，从而取代活体运输，既降低了费用又可避免疾病的传播，还能解决遗传漂变以及人为、环境因素造成的动物生物学特征和遗传特性的改变等问题。
1 胚胎冷冻技术
胚胎冷冻技术是对体内或体外受精所得到的可供移植的胚胎进行冷冻，并根据需要解冻后供移植的一种生物技术。胚胎冷冻技术的发展经历了由繁到简的过程，主要围绕程序简化、缩短冻存时间、选择低温保护剂及冷冻方法、解冻方法等方面进行研究，所选方法和程序的目的都是尽可能减少胚胎在冷冻时的物理损伤，提高胚胎冷冻／解冻后的存活率和移植妊娠率，并产下健康的后代。
1．1 冷冻方法
(1)程序冷冻法
程序冷冻法主要使用渗透较慢的低温保护剂，如乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)，使冷冻保护剂充分渗透人胚胎细胞内，平衡后，利用程序降温仪缓慢降温，最后投入液氮保存。1972年，Whittingham等 首次报导了小鼠胚胎在-196℃ 和-269℃冷冻保存获得成功，引起了科学界的广泛重视。随后相继应用这种方法在牛、兔、绵羊、大鼠、山羊和马等多种哺乳动物上获得成功。
程序冷冻法采用较低浓度的冷冻保护剂，对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高。但因其操作繁琐，降温速度慢，致使所需时间长，需要特殊的降温装置，在不具备实验条件的场所不能使用此法进行胚胎冷冻。目前国内外均较少使用。
(2)玻璃化冷冻法
玻璃化冷冻法是将胚胎或卵母细胞在适当的冷冻保护剂混合液中做短暂处理后，直接投入液氮。与传统的程序冷冻法相比，玻璃化冷冻法的优点主要在于：细胞和液氮直接接触，冷冻速率明显增加；方法简单，缩短了冷冻程序的时间；免除了昂贵的程序降温仪的费用，在一般的实验室就可进行操作。下面介绍几种常用的玻璃化冷冻法。
① 超快速冷冻法
l985年，Rail等 首次应用DMSO、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇组成的玻璃化溶液超快速冷冻小鼠胚胎获得成功。1986年，Scheffen等以25%甘油和25% 1，2一丙二醇玻璃化超快速冷冻牛胚胎，降低了玻璃化溶液的毒性 ；同年，Kasai等 以40 %乙二醇、0．5 mol／L蔗糖和30 Ficoll的混合溶液超快速冷冻小鼠胚胎。获得了较高存活率(98 %)，进一步降低了玻璃化溶液的毒性；2002年，朱士恩等应用以EG和DMSO为主体的抗冻保护剂玻璃化冷冻小鼠原核胚，移植后妊娠率和产仔率与鲜胚的效果相近。2003年，Fujio等以DAP213(2．0 mol／LDMSO+1．0 mol／l 乙酰胺+3．0 mol／L丙二醇)为冷冻保护剂冷冻小鼠获得成功；2005年，Baranyai等 分别用SSV(Solid surface vitrification)法和麦管法冷冻小鼠8一细胞期胚胎，证明了SSV法对于桑椹胚和胚泡阶段的胚胎是一种较好的冷冻方法。
② 开放式拉长塑料细管法(open pulled straws，OPS)
OPS法是丹麦人Vajta于1997年发明的，他使用薄壁细管，利用毛细现象将微量冷冻液滴和胚胎一起吸人管内后，投入液氮。这种方法克服了传统玻璃化的缺点，加快了冷冻速度和复苏速度，其降温速率可达2 500℃ ／min，且对细胞的毒性和损伤作用较小。1998年，Vajta等应用OPS法冷冻牛不同阶段的胚胎，结果表明，受精后3～7 d的胚胎复苏后囊胚形成率为60 ～95 %，和新鲜胚胎无显著差别，且牛卵母细胞复苏后囊胚形成率高达25%，移植后产生3个仔牛。Lazar等应用OPS玻璃化法冷冻了117个牛囊胎，复苏后孵化率为39．5%，移植率和妊娠率分别为16．7% 和50%，均显著高于普通麦管玻璃化冷冻。朱亮等应用OPS法和传统麦管法对小鼠扩张囊胚进行玻璃化冷冻，结果表明，应用OPS法冷冻小鼠囊胚存活率(82．3 %)显著高于应用传统麦管者(68．6％)，且前者的冷冻囊胚孵出率(70．3 %)也明显高于后者(57．1 %)，因此认为OPS法是一种行之有效的冷冻方法。但是OPS法也存在一些不足，由于冷冻液与液氮直接接触，液氮里的一些潜在的污染源会增加污染的机会。
③ 封闭式拉长塑料细管法(closed pulled straws，CPS)
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有图，拷不下，可能有新回复：http://dxy.ac.cn/wiki/thread-664-1-1.html
三步平衡法
（1）10%甘油保存液的配制
取9毫升20%羊血清的PBS，加入1毫升甘油，用吸管反复混合15～20次，经0.22微米滤器过滤到灭菌器内待用。
（2）取含20%羊血清0.3摩尔蔗糖的PBS 2毫升和3.5毫升，分别加入10%甘油3毫升和1.5毫升，配成含6%和3%甘油的蔗糖冷冻液。将3%、6%和10%三种甘油浓度的冷冻液分别装入小培养皿。
（3）胚胎分别在3%、6%和10%甘油的冷冻液中浸5分钟。
（4）胚胎装管
用0.25毫升塑料细管按以下顺序吸入，少量的10%甘油的PBS液、气泡、10%甘油的PBS液（含有胚胎）、气泡、少量的10%甘油的PBS液，加热封口两道（图9-18）。
图9-18 胚胎装管示意图
（5）塑料细管的编号
剪一段（2厘米）0.5毫升塑料细管作为标记外套，内装色纸，注明供体品种、耳号、胚胎发育阶段及等级、制作日期（年、月、日），并在外套管上写明序号备查。
（6）冷冻程序
将细管直接浸入冷冻仪的酒精浴槽内，以1℃/分钟的速度从室温降至-6℃，停5分钟后植冰，再停留10分钟，以0.3℃/分钟的速度降至-36℃，再以0.1℃/分钟的速度降至-38℃，直接投入液氮，长期保存。
（7）冷冻胚胎的解冻
①解冻液的配制 根据上文所述配制出10%、6%和3%甘油的蔗糖解冻液，用0.22微米过滤器灭菌，分装在小培养皿内，第1～4杯分别为10%、6%、3%、0%甘油的蔗糖解冻液，第5杯为PBS保存液。
②胚胎的解冻 胚胎从液氮中取出，在3秒钟内投入38℃水浴，浸10秒钟。
③三步脱甘油 用70%酒精棉球擦拭塑料细管和剪刀刃，剪去棉塞端，与带有空气的1毫升注射器连接。再剪去细管的另一端，在室温下将胚胎推入10%甘油和0.3摩尔蔗糖的PBS解冻液中，放置5分钟后依次移入6%、3%和0%甘油的蔗糖PBS解冻液中，各停留5分钟，最后移至PBS保存液中镜检待用。
胚胎冷冻在零下196℃的液氮环境下，代谢是完全停止的，因此，理论上胚胎可以永久保存。现在的玻璃化快速冷冻技术十分成熟，冷冻胚胎可以使其得到长时间的保存，目的是为了在以后的治疗周期中不再诱发排卵，仅通过移植复苏胚胎获得妊娠，既节约费用，又在最大限度上利用胚胎。 也是在身体状况良好的情况下为未来保存健康的胚胎。
冻胚胎可以保存多久
胎盘放冰箱可以冻多久
胎盘可以冷冻保存多久 1、冷冻：用塑料袋装好速冻，这样保存的时间是最长的，避免了脱干水分。2、冷藏：用塑料袋装好放入保鲜室内，这样保存的时间一周之内不变质。3、水泡：每天换水(春季)可保存3--5天不变质。4、盐培：经水泡洗净后，撒入精盐可保存很长时间，烹时影响口感。5、风干：必须通风、...
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胎盘冷冻能保存多久 一般在冷冻的温度下，胎盘是不会变质的，用塑料袋装好速冻这样保存的时间是最长的，避免了脱干水分，当然很多家庭选择保存胎盘，进行冷冻保存，并不是我们理解的放在冰箱进行冷冻，而是委托专业机构进行冷冻，以保证组织细胞的完整性。以备将来孩子万一出现白血病等需要脐带血治疗的疾病时...
胎盘能放冰箱冷冻吗
是可以放在冰箱里冷冻的是没有问题的，需要的时候拿出来解冻食用就可以了，这样可以延长它的存活时间
河南数十万个冷冻胚胎无人问津,他们的父母在哪?
在当时他们冻胚胎的时候就已经写了同意书，上面也是非常的清楚，如果冷冻的胚胎到期的话他们就会续交，如果逾期的话超过半年这个胚胎也不再受医院保存。所以说这些陪他在后来的事情应该怎样处理，我们还是要征求他们主人的意见，就可以有两种方法，一种是拿去科研，第二种就是可以放弃这种胚胎。其实在现实中...
上万枚冷冻胚胎已冻十年将被销毁, 不是能保存20年?为何现在就销毁?
而且咱们也需要考虑到医院保存这些冷冻胚胎也是要成本的，从名字上就可以看出这些胚胎对于温度要求严格，据专家称冷冻胚胎必须在-196℃保存。就光这个温度就需要一大笔钱才能维持，而且这些胚胎还需要人定期去查看，以免嗝屁，重要的是这些胚胎主人没有继续费用啊，这不是让医院白白浪费资源嘛，医院也是要赚钱...
胚胎可以进行再次冷冻吗
可以冷冻的
厦门万枚冷冻胚胎十年无人问津,当初存胚胎的都是什么人?
众所周知，胚胎是一个全能细胞，在外地的诱导下它可以生长成人们所需要的组织器官，冷冻保存胚胎就是为了以后自己或孩子出现身体疾病的时候有一个保障。虽然目前这项技术还没有成形，但是在有钱人的眼里生命的价值是金钱所不能比拟的。这也就促使在10年前就已经有大批有钱人着手保存冷冻胚胎。不孕不育...
胚胎质量不好,冷冻保存可行吗?
可将多余的胚胎冷冻保存
试管胚胎质量不好冷冻后再解冻是不是容易死掉
1、试管婴儿冷冻胚胎复苏移植免除反复打针及采卵手术的痛苦，减少促排卵对女性身体的伤害。而且卵巢免除了再度刺激，相对卵巢环境也比新鲜周期来得好。2、冷冻胚胎数量多，就可多次胚胎复苏移植，不但大大的提高了试管婴儿的成功率，同时也节省了费用。3、胚胎被置于零下196摄氏度的液氮罐内保存，只要实验室...
河北有数十万个冷冻胚胎仅仅躺在氮罐中,他们的未来何去何从?
在管一春主任的回访中，患者们失联的原因主要有换了住址，移植技术失败，夫妇离婚。医院认为，接下来到底该怎么处理，他们还是希望胚胎的主人再明确下。但我认为，医院这样做实在没必要，既然胚胎冻融知情同意书里写得很清楚，逾期未交费的胚胎不再负责保存，那就按照程序 用于科研或者废弃就可以了。白纸黑...
花豪安神： 在 丁香园( http://dxy.ac.cn ) 找到: 关键词:胚胎冷冻;转基因小鼠;胚胎移植 随着生物工程技术的发展.出现了许多生物工程小鼠品系.促使胚胎冷冻技术得到了广泛应用.胚胎冷冻技术不仅为转基因动物提供可用胚胎.还使胚胎移植不受时间...
东港市13696564236： 冷冻胚胎能存放几年? - ？
花豪安神： 你需要咨询你的手术医生术后多长时间可以妊娠,ta会根据术中的情况给予答复的.冻胚时间虽然不宜过长,但必须你的子宫能够承受怀孕才能考虑解冻移植.请放心,冷冻的胚胎5年之内应该没有太大的问题.
