旋毛虫病的几种诊断方法及比较
旋毛虫病的诊断主要分为病原学诊断方法和免疫学诊断方法。病原学诊断主要都是采用活检方式,漏检率较高,并且会造成创伤,效果不好。而免疫学诊断灵敏度高,已经广泛被利用于人体旋毛虫病血清流行病学的调查。本文主要介绍间接荧光抗体试验(1FAT)、免疫酶染色试验(1EST)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等免疫学诊断方法。
1诊断方法
1.1间接荧光抗体试验(IFAT)
1.1.1感染肌肉组织抗原片的制备取感染旋毛虫病猪的膈肌作材料,经10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋切片,切片厚度5~10微米,明胶-钾明矾溶液作粘片粘附剂。每张载玻片排放2~4块切片。烘干后常规脱蜡,用0.01摩尔pH7.4PBS洗3次后切片,分别经过氧化氢-甲醇溶液及1∶20倍稀释的正常兔血清37℃各处理20分钟,如上用PBS洗后用滤纸条吸干水分或自然干燥即为诊断用抗原片,置4℃冰箱保存备用。
1.1.2荧光抗体的制备
1.1.2.1兔抗猪IgG的制备健康猪血清经饱和硫酸铵盐析,Sephadex~G25脱盐后用DEAE纤维素纯化。用纯化后的猪IgG免疫家兔制得兔抗猪血清后,再按提纯猪IgG的方法提纯兔抗猪IgG。
1.1.2.2抗体的标记精取异硫氰酸荧光素(FITC)3毫克,加入0.5摩尔/升碳酸钠溶液0.3毫升,使FITC充分溶解。取10毫克/毫升的兔抗猪IgG6毫升,在室温下逐滴加入FITC溶液,边加边搅拌,加完后,室温下继续搅拌3小时。
1.1.2.3荧光抗体的纯化及质量鉴定将标记后的荧光抗体溶液在4℃下用0.01摩尔pH7.4PBS透析4~5天,直到再无荧光色素透出为止。经过透析的荧光抗体再经Sephadex-G25层析。用紫外分光光度计分别测495纳米及280纳米处的密度值后算得标记的荧光抗体F/P值为2。
1.1.3测试方法及结果判定抗原片滴加含20%正常兔血清及1%牛血清白蛋白的PBS,37℃孵育20分钟;用PBS冲洗后滴加用含5%正常兔血清的PBS作1∶100稀释的待检血清,37℃孵育45分钟;PBS冲洗后再滴加1∶10倍稀释的荧光抗体溶液,37℃孵育45分钟。PBS冲洗后滴加无荧光甘油缓冲液置荧光显微镜下检查,以切片中肌幼虫切面出现黄绿色荧光者判为阳性。
每批试验应设阳性、阴性参考血清对照和猪正常肌组织切片对照。
1.2免疫酶染色试验(IEST)
1.2.1待检血清实验室感染8周旋毛虫豚鼠血清35份。
1.2.2抗原的制备剖杀经人工感染旋毛虫幼虫2个月的大白鼠,取膈肠肌及后腿内侧肌肉,镜下压片每个视野平均7条幼虫,用磷酸缓冲液冲洗后,用冰冻切片机切成6微米厚的幼虫冰冻切片,每张载玻片裱贴5块组织片,经丙酮固定后;即为IEST抗原片,保存-20℃备用。
1.2.3操作步骤在旋毛虫幼虫冰冻切片上,将测试血清用0.01摩尔/升pH7.4~7.6PBS(含0.05%吐温~20)稀释成5,10,20,40,80,160比例的浓度(起始浓度为血清原液),分别滴于切片上,每次试验设阴性血清对照。置湿盒中,35℃孵育60分钟,用0.01摩尔/升pH7.4~7.6PBS洗涤3次,每次5分钟,吹干,滴加酶标葡萄球菌蛋白A(HRP~SPA),同上孵育洗涤,滴加底物溶液(3′3-二氨基联苯胺四盐酸盐-过氧化氢),室温反应15~20分钟,弃底物,用蒸馏水速洗,趁湿片在普通光学镜下观察反应结果。
1.2.4结果判断根据感染大鼠肌肉切片上的幼虫切面显色的深浅,记录结果。反应不着色(-),反应呈现淡棕色(+)、棕色(++)、棕褐色(+++)。若待检血清lEST滴度≥1∶10(+)时,即为lEST阳性。
1.3酶联免疫吸附试验(ELISA)
酶联免疫吸附试验按非均相测定法可分为10种类型,但常用的有4种:直接型、间接型、双抗体夹心型、固相抗体竞争型。本文主要介绍间接型(常规ELISA试剂盒法)。
1.3.1试剂盒准备根据情况选用合适的ELISA试剂盒。
1.3.2检样的准备在受检猪耳静脉采血2滴,滴于1厘米×2厘米的滤纸片上,将其浸泡于0.01摩尔/升pH7.4PBS(含0.05%吐温-20)2毫升,37℃2小时或4℃过夜,备用。阴阳性血清作1∶200稀释,被检血清作1∶100稀释。
1.3.3操作方法与结果判断
1.3.3.1加样于诊断盒每孔加检样100微升,室温(25℃)静置2分钟。
1.3.3.2反应甩去被检液,每孔加1号试液1滴(40微升),室温静置2分钟。
1.3.3.3洗涤甩去1号试液,每孔加2号试液1滴(40微升),立即用蒸馏水或自来水反复冲洗5次以上。
1.3.3.4显色拍干反应板上的残液,每孔先加3号试液1滴,再加4号试液1滴,轻轻混匀,室温静置2~3分钟。
1.3.3.5判定在白色背景下,兰色为阳性,吸收度≥0.3,无色为阴性,吸收度≤0.1。
2比较
间接荧光抗体试验(IFAT)、免疫酶染色试验(IEST)、酶联免疫吸附试验(ELISA)是旋毛虫病当前诊断常用的免疫学方法。
间接荧光抗体试验(IFAT)较早用于诊断旋毛虫病,优点是制备的荧光标记抗体,可以用于多种抗原、抗体系统的检测。初期用全虫作抗原,用试管法检测后发展为用虫体或带虫肌肉切片作抗原。崔晶等应用旋毛虫幼虫冰冻切片抗原,以IFAT检测216份旋毛虫病人血清,抗体阳性率为90.74%,发病后第1周抗体阳性率70.59%,第2周升至91.30%,有显著差异(P<0.025),至第3、4周分别达95.83%和100%。旋毛虫幼虫抗原片在-20℃至少可保存2.5年而不失活。
免疫酶染色试验(IEST)与ELISA的原理基本相似。陈雅棠等用人工感染旋毛虫大鼠肌肉的冰冻切片作为抗原,用1EST检测待检血清,在11例肌肉活检证实有旋毛虫感染的病人中,阳性率为81.8%,与正常对照组和其它寄生虫感染有明显差别。试验者认为其特异性和灵敏性不低于ELISA。张玉光等用人工感染3个月以上大鼠的膈肌及腿内侧肌制成冰冻切片作为抗原,用IEST和皮内试验对比检测1412名中学生,IEST阳性率为11.4%,皮试阳性率为16.93%。
酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前公认的检测旋毛虫特异抗体的较好的方法,有极高的敏感性和特异性。国外已将检查旋毛虫的ELISA方法作为猪只屠宰前的常规检查。我国经过长期实践,实验技术也得到了不断地改进,已从常规的ELISA发展为SPA-ELISA、DOT-ELISA等,旋毛虫ELISA诊断试剂盒也研究成功并推广试用。现今ELISA已广泛应用于旋毛虫病的流行病学调查和临床诊断。但是ELISA也有缺陷:其操作相对较繁琐且要求的实验条件也较高,基层应用尚有一定困难。
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