CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（5）293FT细胞转染验证 and trouble shooting
先确定目标基因
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（1）
然后对目的基因进行背景调查
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（2）磨刀不误砍柴工
设计sgRNA及引物
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（3）sgRNA及引物设计
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（4）构建sgRNA+Cas9载体
（1）sgRNA+pSpCas9载体用lipofectamine 3000转染至293FT细胞（按照转染试剂的说明书走），确保转染效率> 70%；
（2）72 h后收集细胞提取基因组DNA（按照基因组DNA提取试剂盒的说明书操作）；
（3）使用事先设计好的引物进行PCR扩增，这里使用的酶是NEB公司的Q5 high-fidelity Polymerase，一切按照该酶的说明书严格操作；
（4）将目的条带切割下来并使用胶回收试剂盒回收DNA条带，一切按照胶回收试剂盒说明书进行操作；
（5）回收后的DNA样本，经T7 Endonuclease I 酶解验证错配DNA，部分结果如下：
时间飞逝，上次说提取质粒后验证，这部分就花了一天时间；加上打台风影响细胞复苏，耽误了1-2天，复苏细胞后隔一天立刻传代种板，第二天发现细胞稍微少了一点，又等了一天，转染后虽然是72h应该收sample，但细胞数目略少，可能提取不到足够的基因组DNA，所以让细胞又长了一天，直到百分之80以上的融合度（因为我用的是24孔板）。基因组DNA提取之后立刻进行Q5PCR，跑胶切胶回收，T7EI酶切再跑胶，这个骚操作一天做不完，分了两天做，所以就一下子花了将近十天时间，嘤嘤嘤，这要放在其他组，可能都要被老板骂死了。
为啥不提前准备好细胞，为啥不计数种板，为啥为啥为啥为啥，事实上我自己也觉得不满意，但好在最终得到了想要的结果，在还不确定自己的操作是否足够风骚的时候，请务必要小心谨慎，毕竟每一步都有可能出问题。我在新手期曾遇到过的问题如下：
PRRIS是什么意思?
PRRIS，全称为 Puerto Rican Radar Integration System，中文简称为“波多黎各雷达集成系统”。这个缩写词在英文中广泛用于表示一个雷达系统，它将多个雷达组件整合在一起以提高数据处理和监控能力。PRRIS在军事和政府领域中具有一定的应用，主要应用于雷达技术的集成管理，如海岸防御、空中交通管制等场景中。PR...
crisper case9的应用是什么?
1、遗传疾病的矫正 2、艾滋病毒的治疗 3、癌症治疗 4、RNA编辑 5、分子诊断 RISPR-Cas9定义 RISPR-Cas9是一种基因治疗法，这种方法能够通过DNA剪接技术治疗多种疾病。2017年3月，英国《自然·通讯》杂志发表一项遗传学重要研究成果，利用CRISPR-Cas9系统可拯救失明小鼠。以上内容参考：CRISPR-Cas9 - 百...
crispr基因编辑技术的基本原理
CRISPR基因编辑技术的基本原理是当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。CRISPR（Clustered regularly interspaced short...
Kiss from prris什么意思
prris 之吻的意思
多发性硬化最新临床分型
委员会为4种MS临床特点作出了标准化定义:复发缓解型(RR)、继发进展型(SP)、原发进展型(PP)和进展复发型(PR)。不久之后又建议摒弃复发进展型 MS(relapsing-progressive MS)这一术语,因其含义模糊,并与其它亚型重叠。同时还建议将原有术语慢性进展型(chronic progressive)替换为更特异的术语:SP和PP。针对良性MS和...
新加坡NRIC及PR问题
新加坡PR并不是说你自己到ICA人家就会给你 像我台湾人就是在台湾办了移民 有了PR身分才来这里念书的 新加坡的PR是要你在新当地的成绩够好 人家才会发函通知你去申办PR 不过收到的邀请函也不一定会过 因为要看你近年来的成绩 如果是有进步或者一直都是前面的 这当然很好 但是如果之后不稳定的话......
求以ste结尾的英文单词
高小● 2c3.72* progress ['pr()ugres]['pr)-] n.&v. 前进, 发展, 进步, 促进 retrogress [,retr()u'gres]['retr()ugres] v. 退步, 倒退 transgress [traens'gres][traenz-][tra:n-] v. 违反,违背,犯罪,侵犯,违法,越界 heiress ['E()ris]['E()res][-r()s] n. 女性继承人 ...
program files\/rising\/ris\/scanprxy.dll
不是病毒，哪个是瑞星的dll文件，经常要更新的，而且瑞星是10次更新9次要重启，我都习惯了，楼主不要担心。
有谁知道中国12科蝴蝶种类全部名单,近1300种
链环蛱蝶(黑星环蛱蝶,星三线蝶) Neptis pryeri Butler 单环蛱蝶(二线蝶) Neptis rivularis (Scopoli) 小环蛱蝶(小三线蝶) Neptis sappho (Pallas,1771) 黄环蛱蝶 Neptis themis Leech 朱蛱蝶 Nymphalis xanthomelas Denis et Schiffermüller 黄钩蛱蝶 Polygonia c-aureum (Linnaeus, 1758) 大二尾蛱蝶(双尾蛱蝶,...
黑头穗鹛基本信息
黑头穗鹛，灰喉鸣鹃，属于雀形目莺科穗鹛属，分类学上编号为PASSERIFORMES>Sylviidae>Stachyris nigriceps。这种鸟类体型略小，体长约为13.5厘米。其外观特征包括顶部和颈部背部接近黑色并带有白色纵纹。黑色的长眉纹下有一条白色线，白色的下颊纹上方是灰色的，颏和喉部深灰色。眼睛周围有一圈白色，...
生科立可：[选项] A. 向导RNA可在RNA聚合酶催化下合成 B. Cas9蛋白的作用是破坏DNA特定位点核苷酸之间的氢键 C. 通过修饰Cas9蛋白让它只切开单链,可减少非同源染色体末端间连接的机会 D. 该技术可被用于关闭、启动基因的表达或替换基因
玉环县18556842345： CRISPR/Cas9基因编辑技术是由一条单链向导RNA引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行准确切割的技术,通过设计向导RNA中的识别序列,可人... - ？
生科立可：[选项] A. Cas9蛋白在核糖体中合成需要消耗能量 B. 向导RNA中的双链区遵循碱基配对方式为A-U,C-G C. 向导RNA可在逆转录酶催化下合成 D. 若α链剪切点附近序列为…TCCAGAATC…则相应的识别序列为…AGGUCUUAG…
玉环县18556842345： crispr/cas9的应用 - ？
生科立可： 基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具.但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤,不仅流程繁琐、对技术的要求很高,而...
玉环县18556842345： crispr cas9基因敲出质粒转染可以构建稳定细胞株吗 - ？
生科立可： 基因敲出质粒转染可以构建稳定细胞株 一种是脂质体转染后,单克隆筛选稳定细胞株.另外一种是应用逆转录病毒,慢病毒转染,筛选稳定细胞株. 脂质体转染:在转染24小时后,消化细胞并计数.将细胞种到96孔板,保证每个孔2-3个细胞,这样...
玉环县18556842345： 什么是CRISPR/Cas9技术 - ？
生科立可： CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是最新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术.CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制....
玉环县18556842345： CRISPR/cas9的出现是否意味着RNA干扰已经过时? - ？
生科立可： CRISPS/cas9技术主要用于做基因敲除或基因敲入,随着CRISPS/cas9技术的进一步成熟,RNA干扰确实还显得过时,现在基本上就已经没人做干扰了,CRISPS/cas9技术的基因敲除会使结果更加准确.
玉环县18556842345： 如何利用cas9制作基因编辑动物 - ？
生科立可： Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制.CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 来识别并进行有效的靶向DNA剪切.主要分为两个组成部分Cas9核酸酶和gRNA 两部分.
玉环县18556842345： 怎么用crispr/cas9敲除具体步骤 - ？
生科立可： 通过删除或者添加个别碱基,从而破坏基因的编码区,达到敲除的目的.常见的是由于个别碱基的增加或缺失而引起移码突变.
玉环县18556842345： CRISPR/Cas9 系统作为新一代基因编辑工具,具有操作简便、效率高、成本低的特点.该系统由Cas9和单导向RNA(sgRNA)构成.Cas9是一种核酸内切酶,... - ？
生科立可：[答案] (1)真核细胞中没有编码Cas9的基因,可利用基因工程的方法构建基因表达载体,将Cas9基因导入真核细胞.Cas9的化学本质是蛋白质,蛋白质的合成场所为核糖体,而sgRNA的合成需要转录过程中的RNA聚合酶的催化. (2)如图所示,CRISPR/...
玉环县18556842345： 新一代基因编辑工具由 Cas9(一种限制性核酸内切酶)和向导 RNA 构成.该复合体能与 DNA 分子上的特定序列结合,并在合适位点切断 DNA 双... - ？
生科立可：[答案] (1)若控制合成 Cas9 的基因序列已知,可用化学方法合成目的基因,再构建含目的基因的重组DNA分子导入真核细胞,该过程中需要使用限制性核酸内切酶和DNA 连接酶.上述转基因操作成功的标志控制Cas9基因的表达成功. (2)如图所示,...
