在测定酶活力时,为什么对试剂配置、实际用量、血清用量、温度、PH、作用时间均需严格控制?

在测定酶活力时,为什么对试剂配置、实际用量、血清用量、温度、PH、作用时间均需严格控制?求认真解答~

淀粉酶活力的测定
一、目的
学习和掌握测定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法.
二、原理
淀粉是植物最主要的贮藏多糖,也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料.淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用.淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种.α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉的粘度降低,因此又称为液化酶.β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解,每次水解下一分子麦芽糖,又被称为糖化酶.淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原,生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸,其反应如下：
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比.用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线,用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力.
淀粉酶存在于几乎所有植物中,特别是萌发后的禾谷类种子,淀粉酶活力最强,其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶.两种淀粉酶特性不同,α-淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下迅速钝化.β-淀粉酶不耐热,在70℃15min钝化.根据它们的这种特性,在测定活力时钝化其中之一,就可测出另一种淀粉酶的活力.本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶,测出α-淀粉酶的活力.在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力）,再减去α-淀粉酶的活力,就可求出β-淀粉酶的活力.
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
萌发的小麦种子（芽长约1cm）
2．仪器
（1）离心机
（2）离心管
（3）研钵
（4）电炉
（5）容量瓶：50mL×1, 100mL×1
（6）恒温水浴
（7）20mL具塞刻度试管×13
（8）试管架
（9）刻度吸管：2mL×3, 1mL×2, 10mL×1
（10）分光光度计
3．试剂（均为分析纯）
（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容至100mL.
（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g,溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中,加入50mL蒸馏水,再加入30g酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水定容至100mL.盖紧瓶塞,勿使CO2进入.若溶液混浊可过滤后使用.
（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液
A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7·H2O 21.01g,用蒸馏水溶解并定容至1L.
B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g,用蒸馏水溶解并定容至1L.
取A液55mL与B液145mL混匀,既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液.
（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中.
四、操作步骤
1．麦芽糖标准曲线的制作
取7支干净的具塞刻度试管,编号,按表1加入试剂：
表1 麦芽糖标准曲线制作
试 剂
管 号
1
2
3
4
5
6
7
麦芽糖标准液（mL）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0
蒸馏水（mL）
2.0
1.8
1.4
1.0
0.6
0.2
0
麦芽糖含量（mg）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0
3,5-二硝基水杨酸（mL）
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
摇匀,置沸水浴中煮沸5min.取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20mL.以1号管作为空白调零点,在540nm波长下比色测定光密度.以麦芽糖含量为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线.
2．淀粉酶液的制备
称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm）,置于研钵中,加入少量石英砂和2mL蒸馏水,研磨匀浆.将匀浆倒入离心管中,用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管.提取液在室温下放置提取15～20min,每隔数分钟搅动1次,使其充分提取.然后在3 000r/min转速下离心10min,将上清液倒入100mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液,用于α-淀粉酶活力测定.
吸取上述淀粉酶原液10mL,放入50mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于淀粉酶总活力的测定.
2． 酶活力的测定：取6支干净的试管,编号,按表2进行操作.
表2 酶活力测定取样表
操 作 项 目 α‑淀粉酶活力测定 β-淀粉酶活力测定
Ⅰ- 1 Ⅰ- 2 Ⅰ- 3 Ⅱ- 4 Ⅱ- 5 Ⅱ- 6
淀粉酶原液（mL） 1.0 1.0 1.0 0 0 0
钝化β-淀粉酶 置70℃水浴15min,冷却
淀粉酶稀释液（mL） 0 0 0 1.0 1.0 1.0
3,5-二硝基水杨酸（mL） 2.0 0 0 2.0 0. 0
预保温 将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min
1%淀粉溶液（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
保温 在40℃恒温水浴中准确保温5min
3,5-二硝基水杨酸（mL） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0
将各试管摇匀,显色后进行比色测定光密度,记录测定结果,操作同标准曲线.
五、结果计算
计算Ⅰ- 2、Ⅰ- 3光密度平均值与Ⅰ- 1光密度之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg）,按下列公式计算α- 淀粉酶的活力.
计算Ⅱ- 2、Ⅱ- 3光密度平均值与Ⅱ- 1光密度之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg）,按下式计算（α＋β）淀粉酶总活力.
β-淀粉酶活力＝（α＋β）淀粉酶总活力－α-淀粉酶活力
六、附 注
（1）样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定.
（2）为了确保酶促反应时间的准确性,在进行保温这一步骤时,可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴,准确记录时间,到达5min时取出试管,立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应,以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差.同时恒温水浴温度变化应不超过±0.5℃.
（3）如果条件允许,各实验小组可采用不同材料,例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子,比较测定结果,以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化.
推荐网址：
http://www.estarch.com/news/26/news_6498.html
http://www.bbioo.com/bio101/2006/7201.htm
http://www.scuta.edu.cn/yuanxi/bylw/syzd/srdsyzdsy18.htm

因为RNA极易被降解,如果提取后变成NTP了还有什么意义呐?
时间越短降解越少
温度也是,pH也是,都需要严格控制

谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定

几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强。主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1，4-糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原性糖；β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1，4-糖苷键，水解产物为麦芽糖，并能使一部分糊精糖化。本实验以萌发种子为材料，测定其中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的差异。

【原理】

两种淀粉酶具有不同理化特性，α-淀粉酶不耐酸，在PH3�6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，在70℃下15Min则被钝化。据此，在测定时钝化其中之一，就可以测定出另一种酶的活力，本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力，再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较，求出β-淀粉酶活力。淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3，5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。

【仪器与用具】

分光光度计；离心机；恒温水浴器；研钵；具塞刻度试管25Ml 13支，刻度吸管1ml、2ml、5Ml各1支；容量瓶50Ml 2支。

【试剂】

麦芽糖标准液(1Mg／Ml)：称取100Mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100Ml。

DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸)：精确称取3，5-二硝基水杨酸1g，溶于20Ml 12Mol／L NAOH溶液中，加入50Ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100Ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊，可过滤后使用。

0�1Mol／L PH5�6的柠檬酸缓冲液：A液(0�1Mol／L柠檬酸)：称取分析纯柠檬酸21�01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0�1Mol／L柠檬酸钠）：称取柠檬酸钠29�41g用蒸馏水溶解并定容至1L；取A液55Ml与B液145Ml混匀，即为0�1Mol／L PH5�6的柠檬酸缓冲液。

1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100Ml 0�1Mol／L PH5�6的柠檬酸缓冲液中。

【方法】

1.酶液提取称取25℃下萌发3～4天的小麦种子1�0g(芽长1�0～1�5CM)，置研钵中，加少量石英砂和2Ml蒸馏水，研磨成匀浆后转入离心管中，用7Ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管，提取液在室温下放置提取15～20Min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3000r／Min转速下离心10Min，将上清液倒入50Ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5Ml，放入50Ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液。

2�麦芽糖标准曲线制作取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表18-1加入试剂：

表18-1制作麦芽糖标准曲线配方表

试剂管号1234567麦芽糖标准液（ml)00.20.40.81.21.62.0蒸馏水（ml)2.01.81.61.20.80.40麦芽糖含量（mg)00.20.40.81.21.62.03,5-二硝基水杨酸（ml)2222222摇匀，置沸水浴中煮沸5Min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20Ml。以1号管作为空白调零点，在540nM波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3�酶活力的测定取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表18-2进行操作。

表18-2酶活力的测定配方表

操作项目管号Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅰ-3Ⅱ-1Ⅱ-2Ⅱ-3淀粉酶原液（ml)1.01.01.0000钝化β-淀粉酶置70℃水浴中15Min,取出后在流水中冷却淀粉酶稀释液（ml)000111DNS试剂（ml)2.0002.000预保温40℃恒温水浴中保温10Min1%淀粉溶液（ml)(40℃)1.01.01.01.01.01.0保温40℃恒温水浴中准确保温5MinDNS试剂（ml)02.02.002.02.0摇匀，置沸水浴中5Min，取出后冷却，加蒸馏水至20Ml，摇匀，在540nM波长下比色，记录测定结果。

4�结果计算 用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值与Ⅰ-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg)，再按下式计算α-淀粉酶的活力(Aα)，淀粉酶活性以每克鲜重所含麦芽糖毫克数(Mg／g·Min)表示：

Aα＝CαVTFW×t×V1（18-1）

Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值与Ⅱ-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg)，按式18-1计算(α＋β)-淀粉酶的活性AT�

AT＝CT×VTFW×t×V1

式中A:淀粉酶活性，Aα为α-淀粉酶的活性，AT为淀粉酶总活性，主要是α、β-淀粉酶的活性；

Cα:α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量(查标准曲线求值，以下同)；

CT:(α＋β)淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量；

V1:显色所用酶液体积(Ml)；

T:酶作用时间(Min)；

VT:样品稀释液总体积(α-淀粉酶为50Ml，α＋β淀粉酶为500Ml)；

FW:样品鲜重(g)。

【思考题】

1.萌发种子和干种子α-淀粉酶和β-淀粉酶活力有何差异�这种变化有何生物学意义�

2�实验中设置对照的意义何在�

3�α-淀粉酶和β-淀粉酶性质有何不同�作用特点有何不同

他天天

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大兴区15845041917： 在测定酶活力时,为什么对试剂配置、实际用量、血清用量、温度、PH、作用时间均需严格控制? - ？
桓惠减味： 法1:称取硫酸铜(CuSO4.5H2O)34.7g溶于500ml蒸馏水中.静置一天后过滤.B :称取酒石酸钠钾173g加氢氧化钠50g共同溶于蒸馏水并稀释至500ml,静置二天后过滤 法2:1)取硫酸铜结晶 6.93 g.加水使溶解成 100 ml. (2)取酒石酸钾钠结晶...

大兴区15845041917： 测定酶活力时为什么要将酶液适当稀释,一般稀释多少倍 - ？
桓惠减味：[答案] 一方面浓度过高使反应进度过快使测定结果偏差过大. 另一方面还有产物抑制的原因. 稀释倍数一般看所有用酶的存放时间和活力,而且要考虑单位换算的问题.不能一概而论.比如生提的GPT就不用.

大兴区15845041917： 测定酶活力时为什么要加过量的底物 - ？
桓惠减味： 在一般的酶促反应体系中,底物往往是过量的,测定初速度时,底物减少量占总量的极少部分,不易准确检测,而产物则是从无到有,只要测定方法灵敏,就可准确测定.因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适. 测初速度的原因也是这个,因为只有在初速度下,才能保证底物过量,酶被完全饱和,如果你用反应中某一阶段的速度的话,很难保证底物还是过量的,

大兴区15845041917： 测定酶活性的实验配试剂时为什么要使蛋白质变性? - ？
桓惠减味：[答案] 什么意思?蛋白质变性了还怎么测酶活?

大兴区15845041917： 测定谷丙转氨酶活力时,为什么在制作标准曲线时要加入底物溶液? - ？
桓惠减味： 在制作标准曲线时,加入一定量的底物(内含α-酮戊二酸),主要是用于抵消测定谷丙转氨酶活力时由α-酮戊二酸产生的消光影响,保证标准曲线和实验的反应条件尽量一致.

大兴区15845041917： 用福林酚测酶活力时为什么要在加福林酚试剂之前加入碳酸钠?试剂添加顺序有何影响 - ？
桓惠减味：[答案] 这里有详细的解释,你可以看一下

大兴区15845041917： 为什么测定酶活力时既要有对照又要有空白 - ？
桓惠减味： 空白,可以去除干扰因子,如非酶反应的情况.对照,有利比较和确定单位或含量大小.有了测定的相对的单位活力,扣除干扰因子的情况,就是您要的真正的酶活的结果了. 酶活力的大小可以用在一定条件下,它所催化的某一化学反应的转化...

大兴区15845041917： 进行酶活力测定时应注意什么 - ？
桓惠减味： 测定酶活力时,必须注意以下几点: (1)酶促反应过程中,只有最初一段时间内反应速度与酶浓度成正比,随着反应时间的延长,反应速度即逐渐降低. (2)要规定一定的反应条件,如时间、温度、pH等,并在酶测定过程中保持这些反应条...

大兴区15845041917： 酶活测定方法有哪些原则?最好是详细的答案 - ？
桓惠减味： 一、原则 pH值和温度 体外测定酶活力时选择的测定条件应尽可能接近酶在动物体内的消化环境.干扰成分 侧定酶活力时应尽可能的去除干扰成分.底物 在选择底物时一定要用纯度较高的底物,底物的反应浓度也不应太高.酶样的稀释度 稀释...