细胞培养的具体步骤

细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项~

一、细胞复苏
将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。
加入10ml DMEM培养基清洗，弃上清液。加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。
二、细胞传代
细胞密度达到80%~90%时．去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。
加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。再加入10ml PBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×106/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。
三、细胞冻存
细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。
加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。
冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。
注意事项
（1）进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照下列步骤操作：
①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。
②确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。
③确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行补充。
④确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。为了方便单手开启瓶盖，实验开始前可以把所有瓶盖旋松。
⑤尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷过75%酒精的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接触到瓶口）后在火焰上简单烧灼。
⑥操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净的，必须及时更换。
⑦实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。
（2）细胞污染的预防
①实验用品防止污染。细胞培养所用试剂、耗材、器材的清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌要仔细，并在无菌实验检测阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁、消毒、灭菌。
②操作过程防止污染。
③穿着容易起静电或吸附灰尘的衣物必须更换为白大褂后才能进入细胞间。
④实验开始前需要确定戴的手套没有问题，只要接触过生物安全柜之外的物品，必须及时对手套进行消毒。
⑤进入细胞培养间后关好门，坐下来尽量少走动以免影响生物安全柜的风帘。工作开始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶盖。事先要严格检查所用的器材、溶液和细胞，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大规模污染。
⑥细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口放在火焰周围简单转动烧灼，注意不要让火焰把塑料瓶口烧化。
⑦实验操作时生物安全柜的隔板要尽可能放低，尽量减少谈话，打喷嚏或咳嗽时绝对不能对着工作区，以免造成不必要的污染。
⑧瓶盖应当倒放在远离自己的地方，以避免瓶盖被误操作所污染。
⑨不要从敞开的容器口上方经过，以避免衣服上掉落不明物体对细胞的污染。
⑩实验操作时要注意及时更换巴斯德吸管、移液枪枪头和移液管，切勿一根管子做到底。一旦发现接触了非洁净或者无法确定洁净的物品必须直接丢弃。实验完毕应及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。
（3）防止细胞交叉污染
①在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好作上标记便于辨别。按顺序进行操作，一次只处理一种细胞，多种细胞多种操作一起进行时易发生t昆乱。
②在进行换液或传代操作时，粘有细胞的移液枪头和移液管不要触及试剂瓶瓶口，以免把细胞带到培养基中污染其他细胞。
③所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，必须及时保种冻存，一旦发生污染可重新复苏细胞，继续培养。

扩展资料：
细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。
不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。
细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。
参考资料：百度百科：细胞培养

悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用离心法后，加入新培养基后再吹打分散进行传代
贴壁细胞实验需准备超净台喷洒酒精，紫外照射30min。准备好培养瓶/皿，离心管，10%DMEM，0.25%胰酶，D-hanks液等，带上手套，口罩等，倒去旧培养基，用D-hanks液清洗一遍，去除沉积的死细胞等。
加入2ml 0.25％胰蛋白酶消化液，消化2～3min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。加入1～2滴管含有血清的培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。
以1：2或1：3进行分装，补充新鲜培养基，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。

扩展资料：
注意事项
1、传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。
2、每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。
3、如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。
参考资料：百度百科-传代培养

一、复苏
1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后(大概1-1.5分钟)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来)，1000转离心5分钟。
3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到37℃的5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5.根据细胞增长速度2-3天换一次培养基。
二、传代
1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2.把原有培养基吸掉。
3.加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行)，消化1-2分钟。
4.细胞都变圆后加入等体积的含血清的培养基终止消化。
5.用移液枪吹打细胞，让细胞悬浮起来。
6.把细胞吸到10ml或15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。
三、冻存
把细胞消化下来并离心(同上)。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

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九里区19434593619： 简要说明培养细胞的过程 - ？
泷纪东药： 培养前,应充分做好准备工作,需要一定的条件,包括:无菌、一定的温度(37摄氏度)、一定的营养成分,以避免操作开始以后由于用品不全往返取物,而使污染的机会增加;操作时,由始至终要保持一定的顺序性.组织和细胞未做处理之前,勿过早暴露在空气中.培养液及培养瓶皆应保持斜位或平放,用过之后如不重复利用,应立刻封闭瓶口,同时注意尽量不混用吸管,以防止扩大污染或混淆不同细胞.

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泷纪东药： 待上述各“溶质”完全溶解后,用双蒸水补至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐剂,置40℃保存

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泷纪东药：[答案] 那要看你做什么实验啊,要培养什么细胞啊? 你是要培养动物细胞吗? 动物细胞培养最关键就是一定不要染菌,要不细胞全死了,培养瓶灭菌,最好接种室也用紫外光杀菌,再接着,接种前,买来的细胞要复苏,培养液要配好,复苏之后就可以培...

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泷纪东药： 这个具体得分抄什么组织(一个子一个字打出来的..累死我了)1、一般取出组织之后,先要对组织块进行修剪,去除有害物袭质.以鸡胚为例,取出鸡胚之后,去除头部和内脏,用BSS也进行清洗两次.2、将组织进行剪碎处理,加入一2113定量的胰酶5261进行消化,多放入37°二氧化碳培养箱中静止5分钟左右.3、轻轻的倒掉上清液,并加入一定量的DMEM溶液.4、用纱布进行4102过滤,滤除大的组织块,一般纱布至少六层以上.5、直接将过滤后1653的细胞液,进行率为的处理之后,然后直接分装到培养瓶中,放入培养瓶中进行培养即可.