使用NCBI设计qPCR引物方法

~ NCBI作为科研者的重要工具，其内置的Primer designing tool（或Primer-BLAST）功能强大，特别适用于设计特异性的荧光定量PCR引物。以下是使用该工具设计qPCR引物的步骤概要：

首先，访问NCBI找到目标基因的序列页面，然后点击Pick Primers跳转到引物设计工具。如果你已有基因序列，可直接通过NCBI的BLAST进入Primer-Blast页面。

进入设计页面后，分为四个模块设置参数：PCR模板、引物参数、外显子/内含子选择和特异性检测。在PCR Template部分，输入或选择你的基因序列，设定引物的结合范围。在Primer Parameters中，设定PCR产物大小范围、设计的引物数量和Tm值（默认为60°C），并确认引物特异性检查。

Exon/intron selection部分，选择跨外显子设计以避免DNA污染。在Primer Pair Specificity Checking Parameters中，确认特异性检查并选择合适的数据库和物种，设置对非特异性的排除条件。

高级参数中，可以微调引物特性和探针设计。设置完毕后，点击“Get Primers”获取设计结果。设计结果中，根据特异性、长度、Tm值等特性挑选合适的引物，虽然软件给出的分数仅供参考，但掌握该工具能显著提升实验效率。

总的来说，NCBI的Primer designing tool以其便捷性和预测特异性，简化了qPCR引物设计过程，为分子生物学实验提供有力支持。通过精细调整参数并挑选优秀引物，科研者能够得到满足实验需求的高质量PCR引物。

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保山市13881608087： 如何运用ncbi设计q - pcr引物 - ？
杭薇必坦： 引物大吗? 如果二十几个bp以上的话,能查出来 正向引物不变,反向引物找反向互补序列,(就是说AATCGGATCCTCj就要翻成GAGGATCCGATT)把这两个序列用两个空格分开,或者用逗号隔开去blast,为了精确,应该在高级选项限制条件里选择你要的那种生物,你要的那种基因(比如是酶就选择酶那一类). 然后在结果里认真找哈~~

保山市13881608087： 如何进行pcr引物设计? - ？
杭薇必坦：[答案] NCBI有免费的设计软件 非常好用,权威 把你的序列贴到最上方的空格就可以了,开始的时候,所有的参数都用系统的默认值就可以,不需要修改.

保山市13881608087： 求助在NCBI中找到目的基因该怎样设计引物 - ？
杭薇必坦： 首先 不管是前引物还是后引物,都得在设计引物时在5'端加一段保护序列(网上搜保护序列 有很多) 其次 在保护序列之后要加酶切位点(网上搜酶切位点) 然后 后引物还要加终止密码子(3个随便加) 最后 目的基因前后的序列按5'到3'的顺序分别加在前后引物上

保山市13881608087： DNA序列的PCR引物设计 - ？
杭薇必坦： 1,PCR引物是利用碱基互补原则,通过找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列. 2,首先要找到你用来设计引物的目的基因全序列,一般NCBI、Genebank上都能找得到. 3,引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 ...

保山市13881608087： 如何利用已知基因设计特异性引物? - ？
杭薇必坦： 首先在NCBI进行blast比对,找到基因的特异序列,与其他基因同源性低的区域,然后再这些区域设计引物.还有一种方法是先在基因上设计引物,然后再blast比对引物,看看在你的目的物种中是否有同源基因.

保山市13881608087： 初初学者请教 怎么设计引物??? 最好举个例子, 从ncbi 找 基因 到 用软件(最好是oligo)然后设计引物 - ？
杭薇必坦： 你直接可以用NCBI提供的免费设计软件 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/在最上面的大空格输入你的目标序列,或者直接输入ncbi的基因号也可以.然后到最下面点击“Get Primers＂就可以了.等你熟练后,再可以慢慢练习调整那些参数.至于如何找基因,你到 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore在最上面的空格输入基因名称 就可以了.

保山市13881608087： 麻烦用ncbi设计一对PCR引物,不会用那个程序 - ？
杭薇必坦： 正向:5' GTCACCAGAGCGACAGAT 3' 18 方向: 5' CACAGTAGTAGGTGGCTTCA 3' 20 用其他软件设计引物供参考!如有其它要求请具体说明.

保山市13881608087： 我想学习PCR引物设计可却不知道怎么下手 - ？
杭薇必坦： 你首先要明白,引物是什么?为什么要设计引物?明白了之后,再去看资料和网上设计引物的介绍,一定能明白.关于设计引物的步骤和注意事项,网上太多了,我相信你不是问这个,我跟你介绍一下设计引物的意义,说说实验里的作用吧....

保山市13881608087： 荧光定量PCR引物设计？
杭薇必坦： 完全可以,PCR长度从50bp到数百都可以,不止局限于150-300个碱基对.楼上说的有道理,但是有一点要注意,最好计算一下扩增片段的Tm值,这样做溶解曲线的时候,光有一个峰还不够,而且得到的TM和你计算的Tm相吻合才行. 是否在翻译区没有影响.

保山市13881608087： 你好,我想设计一个基因的某个区段的特异性引物,用以该基因的PCR,请问我该怎么做?？
杭薇必坦： 去NCBI找到这个基因的序列,然后找到你需要的那个区段,在它上下游不改变阅读框的地方设计引物,正向引物在正义链,反向引物在互补序列里设计.20~25bp为宜. 工具的话,可以用到在线设计引物的primer3