提取RNA为什么选幼嫩
常见的RNA提取方法有苯酚法、阴离子去污剂法、LiCl一尿素法、改良的Gomez法、异硫氢酸胍法、CTAB法、热硼酸法及改良热硼酸法、TRIZOL试剂快速提取法。
RNA提取时，就变性剂的选择来说，CTAB（CTAB法）比异硫氰酸胍（RIZOL试剂法）和 SDS（改良热硼酸法）更有效；就CTAB法来说，由于以CTAB为变性剂，同时加入PVP和β一巯基乙醇共同作用变性蛋白、抑制RNase的活性，使用无水乙醇或异丙醇沉淀杂蛋白和总核酸等，然后再选择性地分离出RNA。
组织 RNA 抽提失败的两大现象是： RNA 降解和组织内杂质的残留。关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解。现有的 RNA 抽提试剂，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其 RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的 RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。因此，假定有一种办法，在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的 Rnase 降解 RNA 的速度快。电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎 100% 能获得解决。影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同。总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物，取相应部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白质。
实验前方法/试剂的选择
0：抽提 RNA 的目的
RNA 用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留；Northern 对 RNA 完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出；每次都以获得最高纯度的 RNA 为目的，劳民伤财。
1：样品的收集/保存 – 影响降解的因素
样品离开活体/或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解 RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。传统上，只有两个办法可以彻底抑制内源酶活性：立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻。这两个办法都要求操作快速。后者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。具体地讲，植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来，再往下做。
2：样品的破碎及匀浆 – 影响降解和得率的因素
样品的破碎是为了彻底匀浆，匀浆是为了使 RNA 彻底完整地释放出来。细胞无须破碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。内源酶含量较低并且较容易匀浆的组织可以在裂解液中通过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程；植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等样品，它们不是内源酶含量高，就是不容易匀浆，所以必须将组织的破碎和匀浆分开操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的匀浆方法是使用电动匀浆器。使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾磨过程中，样品不得融化，因为冷冻后内源酶更容易起作用。
3：裂解液的选择 – 影响操作方便程度，内源杂质残留的因素
常用的裂解液几乎都能抑制 Rnase 活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力。
4：纯化方法的选择 – 影响内源杂质残留，抽提速度的因素
对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。
RNA提取的基本操作步骤
RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)
操作步骤：
1. 匀浆处理：
① 组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。
② 单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
③ 细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106 动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2. 将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
5. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。
6. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
7. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
8. 用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。
9. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可。不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5%SDS，用枪头吸打几次，55-60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。
注意事项：
1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。
2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。
研究发现仅在大豆叶肉细胞中存在一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGP...
所以对质粒切割后可以保证目的基因插入部位和方向的准确，不会影响基因表达载体的表达．（4）用基因枪法转化时，选择幼胚细胞的原因是幼胚细胞分裂旺盛，全能性高，容易诱导形成植株．故答案为：（1）大豆叶肉 在低温条件下快速提取（或加入适量的RNA酶抑制剂）（2）PCR 高 ...
RNA的测序原理及方法!^~^
next generation sequencing就直接测RNA，传统的还是先转cDNA，原因么应该是rna比较脆弱啦。。。cDNA比较稳定。不过弊端还是很多的比方一个很突出的就是3’端bias。。所以现在有了next generation 的rna seq。原理是一样的不过就是直接测RNA了。third generation里边就开始测single molecule了，像前两天ibm说...
酵母中提取的RNA还具有生物学活性吗?
酵母中提取的RNA还具有生物学活性。酵母RNA是从天然酵母中提取的核糖核酸。酵母由于种属不同自身所含的核酸（RNA）由3——15%不等，核酸是重要的遗传物质，对生命体的意义非常重大，因此国内外一些酵母生产的大公司，都先后依靠自身的酵母资源对酵母进行深加工综合利用，生产酵母核酸产品。酵母核酸是通过现...
如何观察small rna测序质量
细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类，不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白，DNA等杂质，最终获得高纯度RNA产物的过程。RNA 提取流程 1. 样品处理 从各种不同来源样品（如细菌、酵母、血液、动物组织、植物组织和培养细胞）,或同一来源样品的不...
为什么有时候微小rna的靶基因,蛋白水平下调并不明显
微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一类基因组编码、非蛋白质编码的小RNA,在转录后水平负性调节靶基因表达。本研究探讨miRNAs在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)主动脉的表达特征及其与高血压的关系。取4、8、16和24周龄雄性SHR大鼠及同龄正常血压对照(Wistar-Kyoto,WKY)大鼠。MiRanda、...
什么人适合补充核酸?
婴幼儿、孕妇和消化功能衰退的老年人适合补充核酸。核酸有维持机体正常免疫，抗生物氧化，促进细胞增殖分化，影响生物合成，影响其它营养素的吸收与利用等功能。从核酸对机体各系统的影响来看，免疫系统是最敏感也是最直接受影响的系统。尽管体内可合成核酸，但无核苷酸饮食或低核苷酸饮食配方饲喂的实验动物，其...
核酸、核苷酸、dna、rna的关系
组成核酸的基本单位是核苷酸,脱氧核糖核酸就是DNA,核糖核酸就是RNA,他们的基本单位分别是脱氧核苷酸,核糖核苷酸. 核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物,为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内,生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸,其化学组成、核苷酸排列顺序等不同...
求高中生物选修一知识点
7、细胞膜的选择透过性:这种膜可以让水分子自由通过,细胞要选择吸收的离子和小分子(如:氨基酸、葡萄糖)也可以通过,而其它的离子、小分子和大分子(如:信使RNA、蛋白质、核酸、蔗糖)则不能通过。8、膜蛋白:指细胞内各种膜结构中蛋白质成分。9、载体蛋白:膜结构中与物质运输有关的一种跨膜蛋白质,细胞膜中的载体...
鸟类对人类有什么益处?
燕子还会选择在人类住所周围筑巢,以进一步控制害虫数量。 除了控制害虫数量,鸟类还有助于传播植物的花粉和种子。当鸟类在花朵间穿梭时,会沾染花粉,并在飞行中将花粉传播到其他花朵上,促进植物的繁殖和生长。 同样地,当鸟类吃掉水果或坚果时,它们会排出未消化的种子,帮助植物繁衍。因此,鸟类在维持生态平衡方面扮演着重要...
在你看来毛毛虫是怎么变成蝴蝶的?
赞同，是同一组基因。虽然是同一组DNA，这是一个源头，但是，DNA再转录RNA，然后在表达出器官等一系列过程，中间还是有很多因素影响的。 所以，同一个DNA在不同的时间上，可以有不同的表达。激素控制基因表达的分子生物学机制都是差不多的。激素分子与细胞膜表面受体分子结合，受体分子激活一系列中间信号...
冷寒乳杆： 不会一点RNA都没有,但是这样的做法不好,放冰箱的降温速率有限,RNA会有变化.RNA最好新鲜提取,即便不能新鲜提取,也要用液氮深度冷冻一下再放-80冰箱保存.
夏河县13739111068： 植物RNA为何不易提取 提RNA总是提不出来,为什么? - ？
冷寒乳杆： 可以选择RNA表达高峰时期的植物组织来提取,比如幼苗.还有就是注意RNA酶的降解.
夏河县13739111068： 植物基因组提取要注意什么? - ？
冷寒乳杆： 组织要尽量选幼嫩的,操作注意保持低温、无菌、快速,再有的实验指导上应该有吧,不同的实验注意事项也不同.
夏河县13739111068： 提植物RNA如何取材 - ？
冷寒乳杆： 你需要研究植物哪个部位的基因,就提取哪个部位的RNA.不同部位的RNA总类是不一样的,小型植物可以取整株,大型植物就看你研究的目的.植物组织越新鲜,越好提取.
夏河县13739111068： 如何选择最佳的全血DNA,RNA提取方法 - ？
冷寒乳杆： 如何选择最佳的全血DNA、RNA提取方法?从全血中提取DNA和RNA应该说是最基本的工作了,提取的DNA和RNA质量的好坏直接影响了下游的实验和分析,可供选择的方法非常多,乱花渐欲迷人眼,如何选择最适合的方法,成了很多人实验...
夏河县13739111068： 为什么硫代硫酸钠可以用作定影液,从软硬酸碱的角度如何解释 - ？
冷寒乳杆： 为什么硫代硫酸钠可以用作定影液,从软硬酸碱的角度如何解释w!`;W(~,E:i3^3、离心,取上清,氯仿抽提一次.,|(Z0d;j2@7m+d2Q&xH4、取上层水相,加1/10倍体积的3M乙酸钠(pH5.2)及2倍体积的乙醇,-20℃放置1小时,5000g离心(...
夏河县13739111068： 观察RNA的分布时为什么选择色泽浅的细胞?感谢~~ - ？
冷寒乳杆： RNA与健那绿结合后很容易在显微镜下观察
夏河县13739111068： 如何从组织中提取RNA和DNA - ？
冷寒乳杆： 这个问题应该这样考虑: 根据所得到的组织的量的多少及珍贵程度,看是用kit还是用Trizol来提取. 组织有没有经过处理,比如经过了固定什么的,如果要提取核酸,要用专门的kit来做. 还有,根据所提取出来的核酸的用途来看,比如提取的RNA是做qPCR,还是做表达谱芯片的,DNA是做CNV分析的,还是做基因型分析的.在以上各种情况下,才能方便讨论如何提取核酸.
夏河县13739111068： 碱法提取RNA所得RNA是否为纯品?如何进一步纯化? - ？
冷寒乳杆： 不是纯品.稀碱法提取的RNA中含有DNA分子,直接加NaOH溶液与提取液混合搅拌,然后离心就可以了.因为RNA可溶于NaOH溶液,而DNA不可溶,离心后的上清液就不含有DNA了.
夏河县13739111068： 有关RNA提取的问题 - ？
冷寒乳杆： RNA极易变性,你那样不可能提到,顶多是DNA.提取RNA需要加入极强的蛋白质变性剂,比如:异硫氰酸胍!目前提取RNA的方法:用酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提!注意事项:提取用的玻璃器皿要经过高温焙烧,塑料用具经过高压灭菌,不能灭菌的用0.1%的焦炭酸二乙酯处理,再煮沸以除净焦炭酸二乙酯;在破碎细胞细胞的同时加入强的变性剂使RNase失活;在RNA反应体系中加入RNase的抑制剂.
