以下哪些是目前对cnv进行检测的方法

作者&投稿:姬很 (若有异议请与网页底部的电邮联系)
~ CNV,即拷贝数变异(copy number variation),一般指长度为1kb到几个Mb基因组大片段的拷贝数复制、缺失。CNV在基因组中的存在形式主要有以下几种:两条同源染色体拷贝数同时出现缺失;1条同源染色体发生缺失,1条正常;一条同源染色体出现拷贝数重复,另一条正常;1条同源染色体出现缺失,另一条出现拷贝数重复;两条同源染色体同时出现拷贝数重复。
CNV在人类基因组中分布广泛,是人类疾病的重要致病因素之一。致病性CNV可引起智力障碍、生长发育迟缓、自闭症、各种各样的出生缺陷、白血病和肿瘤等多种疾病。目前对CNV进行检测的方法主要有aCGH, SNP-array, CNV-seq、MLPA等,这些方法各有哪些优缺点,我们又该如何选择?
检测方法一:aCGH
aCGH也称为基于芯片的比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization)。
原理:将等量的待测DNA和正常对照DNA分别用红色和绿色荧光染料标记,混合,然后与全基因组DNA芯片进行竞争性杂交。杂交后的芯片经激光扫描,比较每个点红光和绿光的发光强度。若红光过强,表明待测样本拷贝数复制;若红光较弱,表明待测样本拷贝数缺失;若红绿光均等,则表明待测样品拷贝数正常。
应用:可以检测全基因组水平上的CNV。
点评:aCGH的分辨率,取决于芯片中探针在全基因组中的密度和探针长度。安捷伦SurePrint G3 Human CGH Microarray 1×1M芯片中,探针间距约为2kb。因为来自一个点的荧光的光强变化,可能会带有一定的偶然性,所以,一般是看染色体空间位置上相邻的3个点(或者更多的点),如果这3个点的荧光比值,都发生同一个方向的偏离,就可以判断这一段有拷贝数变异的证据。基于这点考虑,按照3个点计算,aCGH的分辨率约为6kb。
检测方法二:SNP-array
SNP(Single Nucleotide Polymorphisms,单核苷酸多态)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性而形成的遗传标记。SNP在人类基因组中广泛存在,平均约每500-1000个碱基对中就有1个SNP,人类30亿碱基中大约有300万个。
原理: 与aCGH采用的双杂交策略不同的是,SNP-array利用待测样本与芯片探针进行单杂交,通过比较不同样本信号的强度来确定每个位点的拷贝数。
应用:SNP-array芯片的探针为SNP位点序列,可以提供SNP信息。除可检测CNV外,还可检测单亲二倍体(UPD)、杂合性缺失(LOH)和嵌合体。
点评:SNP 芯片探针在全基因组上的的密度非常大,分辨率很高。但是这些探针在基因组中并非均衡分布,在一些重复序列和复杂的CNV 区域, SNP 密度是较小的,不能得到较为清晰的CNV 图谱。Affymetrix 公司和Illumina 公司在新一代芯片中增加一个非多态性的探针,将探针更好地定位在特定区域,提高图谱的清晰度。目前Affymetrix 公司的CytoScan HD芯片为探针密度最高的芯片,含有270万个探针,基因间探针间距平均为1kb。按照3个点计算,SNP-array的分辨率约为3kb。

单倍体基因组中等位基因核内复制事件的检测
图中分别显示:四倍体、三倍体、二倍体、单倍体
检测方法三:CNV-seq
CNV-seq,即通过低倍全基因组测序检测CNV的技术,2009年由Xie[1]等开发提出。
原理:CNV-seq检测原理与aCGH相似。将等量的待测样本DNA和正常对照DNA建库测序后,分别与reference sequence进行对比。通过比较两个样本每个滑窗内比对reads数目的多少来确定每个位点的拷贝数。
应用:可以检测全基因组水平上的大片段CNV。
点评:贝瑞和康采用双盲实验设计,对染色体结构异常的样本进行检测,滑窗大小为20kb的情况下,CNV-seq和高密度SNP-array对于已知致病CNVs都能达到100%的检出[2]。与中等密度SNP-array相比,CNV-seq表现更优。鉴于CNV-seq价格较低,CNV-seq可以替代微阵列芯片用于大片段CNV检测。关于CNV-seq的分辨率取决于滑窗的大小。一般来讲,如果是低倍基因组测序,要使滑窗内的reads数目可信的话,所取的滑窗不可能太小。根据文章2描述,以20kb滑窗大小计算,按照3个点计算,CNV-seq的分辨率约为60kb。

aCGH和CNV-seq检测CNV过程比较
检测方法四:MLPA
MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplication,多重连接依赖式探针扩增)于2002年由荷兰学者Dr.SchoutenJP等首先提出,是针对待检DNA靶序列进行定性和半定量分析的技术。
原理:在DNA靶序列的特定变异位点(如点突变)两侧设计一对MLPA探针。每条探针包含一段通用引物序列和一段特异性杂交序列。杂交序列与靶序列杂交后,使用连接酶将两部分探针连接成一条核苷酸单链,再使用通用引物进行PCR扩增。通过比较待测DNA与正常对照DNA的PCR产物量,来确定待测样本DNA靶序列的拷贝数。值得注意的是,连接酶很挑剔,只有在检测位点处探针与靶序列完美互补配对的情况下,连接酶才能将两部分探针顺利连接成单链进行后续扩增。如果检测位点存在甲基化、点突变、CNV,则探针连接失败,不能进行后续PCR扩增。
应用:验证高度怀疑的特定基因中的点突变、甲基化、CNV。
点评:该技术具有快速及特异性高的特点,但是不能对染色体组进行全局分析。单一反应管内可以同时检测40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。


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