如何设计一种检测动物或植物中某病毒的免疫学方法(只有已知的该病毒标准抗原)

免疫学检验试题~

浙江省2010年1月高等教育自学考试
免疫学及免疫学检验（二）试题
课程代码：01658

一、单项选择题（本大题共25小题，每小题2分，共50分）
在每小题列出的四个备选项中只有一个是符合题目要求的，请将其代码填写在题后的括号内。错选、多选或未选均无分。
1.免疫应答的识别阶段中主要参与识别、摄取、降解、递呈抗原信息的细胞是（ ）
A.B细胞 B.T细胞
C.NK细胞D.巨噬细胞
2.沉淀反应中抗体过量的现象称为（ ）
A.前带B.后带
C.等价带D.带现象
3.用已知抗原或抗体检测相应的抗体或抗原，是根据抗原抗体反应的（ ）
A.特异性B.比例性
C.可逆性D.亲和性
4.制备O抗原对细菌的处理方法是（ ）
A.100℃加温2~2.5hB.0.5%甲醛
C.75%乙醇D.1%氯化钙
5.下面说法正确的是（ ）
A.免疫佐剂先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答
B.颗粒性抗原多使用佐剂作皮内注射
C.超速离心法仅用于分离小分子抗原
D.采用盐析法分离纯化蛋白质可影响其活性
6.基因工程抗体对杂交瘤单克隆抗体的优点关键在于（ ）
A.纯度高B.产量多
C.容易获得D.非异源性
7.下列哪项不是双特异性抗体分子的应用？（ ）
A.免疫学诊断B.肿瘤放射显像
C.介导药物杀伤D.介导补体的生物学活性
8.下列说法正确的是（ ）
A.免疫浊度试验是抗血清效价滴定的常规方法
B.絮状沉淀试验是抗血清效价滴定的常规方法
C.单向扩散试验是抗血清效价滴定的常规方法
D.双向扩散试验是抗血清效价滴定的常规方法
9.单向免疫扩散试验中，小分子抗原和较短时间扩散（24h）的结果处理宜用（ ）
A.Mancini曲线B.Fahey曲线
C.海德堡曲线D.直线
10.下列抗原抗体反应中不属于沉淀反应的是（ ）
A.单向免疫扩散试验B.免疫电泳
C.肥达反应D.免疫比浊
11.直接Coombs试验检测何类抗体？（ ）
A.结合在红细胞表面的IgGB.游离的IgG
C.结合在红细胞表面的IgMD.游离的IgM
12.关于正向间接凝集试验，下列说法错误的是（ ）
A.抗原致敏载体B.用于检测标本中的抗体
C.出现凝集为阴性D.敏感性高
13.CH50试验是以什么作为判断终点？（ ）
A.25%溶血B.50%溶血
C.75%溶血D.100%溶血
14.机体补体水平下降常见于（ ）
A.急性炎症B.组织损伤
C.类风湿性关节炎D.某些恶性肿瘤
15.关于酶免疫技术的特点，正确的是（ ）
A.酶标记物催化抗原反应，使其结果放大，提高了检测的灵敏度
B.酶活性易受理化因素的影响，酶标记物稳定性差
C.选择高质量的标记用酶是建立酶免疫技术最重要的前提
D.底物以酶催化后的成色，使酶标记免疫反应结果得以放大
16.检测抗原抗体最常用的方法是（ ）
A.凝集试验B.化学发光免疫技术
C.ELISAD.间接荧光抗体染色法
17.PEG广泛应用于RIA实验作沉淀剂的原因是（ ）
A.非特异结合率低B.其沉淀效果不受温度的影响
C.能非特异地沉淀大分子蛋白质D.能特异地沉淀小分子抗原
18.下列哪种方法制备的胶体金是红色的？（ ）
A.白磷B.维生素C
C.枸橼酸三钠D.硼酸钠
19.化学发光酶免疫测定系统中常用的酶是（ ）
A.辣根过氧化物酶B.β-半乳糖苷酶
C.碱性磷酸酶D.A和C均是
20.淋巴细胞分离方法中的玻璃器皿粘附分离法是利用单核细胞的如下特点（ ）
A.贴壁生长特点B.体积不同特点
C.形态不同特点D.比重不同特点
21.评价B细胞功能的试验是（ ）
A.淋巴细胞的细胞毒试验B.血清中免疫球蛋白试验
C.迟发型皮肤过敏试验D.CD3检测
22.抗病毒活性测定常用于（ ）
A.IFNB.IL
C.TNFD.SCF
23.评估肾小球滤过膜受损程度，常测定（ ）
A.尿IgGB.尿IgM
C.血IgGD.选择性蛋白尿指数
24.I型超敏反应患者常表现（ ）
A.血清IgG含量增高B.血清IgG含量降低
C.血清IgM含量增高D.血清IgE含量增高
25.室间质量评价（ ）
A.是对实验室操作和实验方法的即时性评价
B.可以帮助实验室对自己的实验操作进行纠正
C.室间质量评价为室内质量评价的补充，属于实验室的内部质量控制措施
D.可以提高实验室常规工作中批内、批间样本检验的一致性

二、填空题（本大题共8小题，每小题1分，共8分）
请在每小题的空格中填上正确答案。错填、不填均无分。
1.补体的三条激活途径是经典途径、______和MBL途径。
2.弱酸性的离子交换剂随着______的增大，电荷基团解离增加，交换容量加大。
3.抗血清的鉴定内容包括效价、______、亲和力和纯度等。
4.补体滴定时，以发生______的最少补体用量为1个实用单位。
5.ELISA中最常用的酶有辣根过氧化物酶和______。
6.放射免疫技术主要包括放射免疫分析（RIA）、______和固相放射免疫分析（SPRIA）三种类型。
7.细胞因子检测最方便和可靠的方法是______检测法。
8.化妆品安全性评价的免疫学检验常用方法是人体斑贴试验，实际是对化妆品所致的皮肤______型超敏反应的检验。

三、名词解释（本大题共4小题，每小题3分，共12分）
1.抗原（Ag）
2.多克隆抗体
3.凝集反应
4.荧光猝灭

四、简答题（本大题共5小题，每小题6分，共30分）
1.简述抗原抗体反应的特点。
2.简述免疫浊度测定的基本原理。
3.简述凝集反应的实际应用。
4.对照RIA，分析IRMA的优缺点。
5.ELISA用于细胞因子测定的优缺点有哪些？

这个得具体问题具体分析。看你想达到什么检测目的了，另外还得看是什么病毒，存在于动植物什么部位。最简单的就是沉积实验：用标准抗原免疫鼠或兔等使其产生抗体，再用其血清作个沉积实验就可以了。这个实验不敏感，需要抗原抗体量较大，如果是特殊病毒或是感染初期，则检测不到。如果你有条件的话可以做ELISA，这个实验敏感性强。
一,基本原理
它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定.测定的对象可以是抗体也可以是抗原.
在这种测定方法中有3种必要的试剂:
①固相的抗原或抗体(免疫吸附剂)
②酶标记的抗原或抗体(标记物)
③酶作用的底物(显色剂)
测量时,抗原(抗体)先结合在固相载体上,但仍保留其免疫活性,然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物),此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性,当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后,
再加上酶的相应底物,即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色.
其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比.

这种有色产物可用肉眼,光学显微镜,电子显微镜观察,也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定.

其方法简单,方便讯速,特异性强.
二,酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物.是ELISA成败的关键试剂,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应,还具有酶促反应,显示出生物放大作用,但不同的酶选用不同的底物 ,将得到不同的颜色反应.
360,450
420
荧光
黄色
甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)
硝基酚半乳糖苷(ONPG)
β-D-半乳糖苷酶
405
420
黄色
深蓝色
ABTS+HRP+葡萄糖
葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
葡萄糖氧化酶
400
500
黄色
红色
4-硝基酚磷酸盐(PNP)
萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
碱性磷酸酯酶
492
460
449
425
642
橘红色
黄色
棕色
兰色
蓝绿色
邻苯二胺
四甲替联苯胺
氨基水杨酸
邻联苯甲胺
2,2'-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐
辣根过氧化物酶
测定波长
显色反应
底 物
酶
ELISA的种类和变化
(一)双抗体夹心法
(二)间接法
(三)竞争法
(四)双位点一步法
(五)捕获法测IgM抗体
(六)应用亲和素和生物素的ELISA
(一)双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相
载体连接形成固相抗体
洗涤除去未结合的
抗体及杂质
加入封闭蛋白溶液以封闭载体
表面残留的蛋白结合位点
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本(抗原)形成
固相抗体-抗原复合物
洗涤除去其他
未结合的物质
加酶标抗体生成
抗体—待测抗原—酶标记抗体
的复合物
彻底洗涤
未结合的
酶标抗体
加底物进行
酶催化反应
根据颜色反应的
程度进行该抗原
的定性或定量测定
间接法是检测抗体最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体,故称为间接法.
(二)间接法
包被固相载体:
用已知抗原包被
固相载体
加待检标本:
使相应抗体与固相抗原结合
洗涤,除去无关的物质
加酶标抗抗体:
与固相载体上抗原抗体
复合物结合;洗涤,除去
未结合的酶标抗抗体
加底物
显色
根据颜色反应的程度进行
该抗原的定性或定量测定
(三)竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定量测定,也可用于测定抗体 .
用已知特异性
抗体包被
固相载体
测定管加待测抗原和
一定量的酶标抗原使二者与
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原
与固相抗体直接结合
分别洗涤
除去未结合
的成分
加底物显色
分别测定两管的吸光度值,
根据对照管与测定管吸光度值之比,
计算标本中待测抗原含量
对照管由于只加酶标抗原,与固相抗体充分结合,故分解底物显色深;测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异.如待测抗原量多,竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合,使固相上结合的酶标抗原量减少.因此,加入底物后显色反应较弱.
特点一:灵敏性
该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶.众所周知, 酶是一种有机催化剂,很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ,产生可供观察的显色反应现象.因此该体系常被称为酶放大体系.ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位,或在微克,甚至纳克水平上对其进行定量.
例如,在测定血清中某一物质的含量时,化学比色法的敏感度为mg/ml水平,酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml .
特点二:特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性.抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间.由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系,所以抗原抗体反应具有高度的特异性.

例如乙肝病毒中的表面抗原(HBsAg),e抗原(HBeAg)和核心抗体(HBcAg),虽来源于同一病毒,但仅与其相应的抗体结合,而不与另外两种抗体反应.抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物(例如血清)中测定某一特定的物质,而不需先分离待检物.
ELISA应用实例
饲料中盐酸克伦特罗的测定
饲料中毒素的测定(主要包括黄曲霉毒素, 简曲霉毒素 )
饲料中有害微生物的快速筛检 (如沙门氏菌 )
甲胺磷残留分析
甲基对硫磷残留分析
呋喃丹残留分析
ELISA在饲料安全检测中的应用
ELISA用于农药残留的检测
河豚毒素
植物毒素如罂粟碱,吗啡,藻类毒素
苯并芘
主要有除草剂与杀虫剂两大类
例如杀暝松( FN ),
甲氟磷酸异已酶( SOMAN ),
草不绿( Alachor ),
西维因( Carbaryl ),
多菌灵及克菌丹( Captan )等.
农药的检测:
ELISA检测 "非典型肺炎"冠状病毒
ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2(hnRNPA2)/类风湿性关节炎(PtA)33抗体
ELISA在疾病诊断中的作用
ELISA法检测幽门螺杆菌抗体
ELISA试剂盒商业资讯
ELISA试剂盒
酶联免疫井
DNM-9602G酶标分析仪
DNM-9602 标配酶标分析仪
DNM-9602A酶标分析仪
几种酶标分析仪
(一) 原理
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牵9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

(二) 操作步骤
方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
方法二 用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

(三) 试剂器材
1. 试剂
(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):
NaCO3　1.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸馏水至1000ml
(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml
(3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清与洗涤液配成5～10％使用。
(4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。
(5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸枣柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。
(6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl
(7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl
(8) 抗原、抗体和酶标记抗体。
(9) 正常人血清和阳性对照血清。
2. 器材:
(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。

(四) 注意事项
1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
（2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

荧光抗体技术
它是一种抗原抗体反应的特异性有与荧光标记分子相结合的方法.即用荧光物质标记已知抗原,这种荧光标记的抗原不影响抗体和抗原相结合,又可在荧光显微镜下观察到发荧光的抗原抗体复合体,不仅可以定性还可以用于定位.

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怀宁县13246951899： 想检测某只动物有没有禽流感,,请问怎么检测? - ？
畅审双北： 本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术,针对HA基因设计特异引物和探针,对H9亚型禽流感病毒RNA的进行定性检测.检测灵敏度:对于接种的鸡胚尿囊液,检测的最高稀释...

怀宁县13246951899： 急求一个有关病原微生物的实验方案 - ？
畅审双北： 如果真的是突发的需要紧急测量的话,最好用试剂盒,否则实验恐怕得一个月…… 如果是脊椎动物得的病,先给得病的人或动物做一个血常规,看看是哪种白细胞增多就能初步判定是细菌还是病毒(真菌很难侵染动物的),然后如果是病毒的话,好象是照相判断大概范围再提基因组(好象是)……如果是细菌,要提16SRNA再去NCBI上比对是快的办法,而其他的指标都要配一大堆形形色色的培养基挨个观察……支原体医院检查一般好象是DNA探针杂交,应该不慢,但我不知道具体多少时间…… LZ能规定一个宿主范围吗?这样我们更容易回答一点……

怀宁县13246951899： 植物病毒的ELISA检测方法有几种啊,能详细讲解吗?不胜感激~~ - ？
畅审双北： 你是单抗还是多抗啊?如果是多抗就好办了(上下用同一抗体),一般是用夹心法.如果单抗的话,可能得两株了.把抗体包被在酶标板上.封闭.再加抗原(已知浓度的病毒或者蛋白).再加抗体(多抗加同一种,单抗加不同种),加酶标二抗.加TMB湿色液,终止,读数.实际过程也不是一两句说得清的,多查一下资料吧.浓度得自己摸索一下.各种缓冲液网上基本可以找到的.

怀宁县13246951899： 怎样设计实验来验证一个物体上有微生物的存在 - ？
畅审双北： 微生物是指那些个体体积直径一般小于1mm的生物群体,它们结构简单,大多是单细胞,还有些甚至连细胞结构也没有.人们通常会借助显微镜或者电子显微镜才能看清它们的形态和结构.需要说明的是微生物是一个比较笼统的概念,界线有时...

怀宁县13246951899： 如何证明动物的某种疾病是由某种微生物引起的,设计详细的实验过程来加以证明 - ？
畅审双北： 该题其实就是科赫法则的内容 1、 在动物的每一相同病例中都出现这种微生物; 2 、要从该动物中分离出这样的微生物并在培养基中培养出来; 3、用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的动物,同样的疾病会重复发生; 4 、从试验发病的动物中能再度分离培养出这种微生物来.

怀宁县13246951899： 如何评估一种或几种病毒的毒力 - ？
畅审双北： 确定病毒的毒力最常用经典方法:TCID50,半数细胞培养物感染量;EID50,半数鸡胚感染量,还有就是用动物测定LD50. 一般如果做毒力检测,最常用,也是最直接的就是做生物测定. 间接测定的话,可以用ELISA、电泳、HPLC等各种方法进行毒素的测定,当然如果你确定病毒的毒力因子的话,也可以用PCR、Western进行检测.

怀宁县13246951899： 怎么用柯赫法则鉴定植物病毒病 - ？
畅审双北： 柯赫氏法则(Koch's Rule)又称柯赫氏假设(Koch's postulates)或柯赫氏证病律,是确定侵染性病害病原物的操作程序.如发现一种不熟悉的或新的病害时,就应按柯赫氏法则的四个步骤来完成诊断与鉴定.诊断是从症状等表型特征来判断...

怀宁县13246951899： 马铃薯常见病毒指示植物的检测方法是什么? ？
畅审双北： 病毒检测技术性强,对设备和用品的要求非常高,开展这项 工作时,如果本单位人员、设备技术条件不足或没有十足把握 时,最好的做法是将要用来脱毒的品种材料送到...

怀宁县13246951899： 如何用农作物病毒检测仪预防植物病害流行?农作物病毒检测仪有哪些功? ？
畅审双北： 植物病害检测仪等植物病害监测仪器的应用,可以说是为预防和监测各种植物病害提供了一种有效的方式,有助于进一步加强了植物病害的预测预报工作,在科学的预测和...