利用质粒抗生素筛选标记进行转化子筛选的机理

质粒转化的其他方法有哪些？转化子筛选的原理？~

一般转化有电转化也化学转化两种，此外也有利用噬菌体来转化的
筛选看你用的是什么筛选标记，常用的是抗生素筛选，也有营养缺陷性筛选等等

用于基因工程的许多质粒载体含有编码抗生素抗性的基因，如pBR322携带有氨苄青霉素抗性基因（amp）和四环素抗性基因（tet）。这些基因作为载体的标记，其中一个（如amp）可以用来选择转化子。因转化子能在含有抗生素的琼脂糖培养基上形成菌落，而非转化的细胞被杀死。另一个基因（如tet）可以用作重组的质粒载体的标记，因为目标序列插入此基因导致插入失活。因此，用重组质粒转化的细胞仅对amp有抗性，而环状（天然）质粒转化的细胞对amp和tet都有抗性。

区分这两类转化体的一种方法是使用复制平板：

1. 转化体首先放在含氨苄青霉素的琼脂培养基的培养皿上生长，过夜培养后，两种类型的细菌均会产生单一的菌落。

2. 将一张无菌茸板轻轻压在培养皿表面，使一些细胞转移到板上。

3. 将板上的细菌接种在含有四环素的琼脂培养基上（即一个复制平板）：任何仅能在第一个平板上生长的菌落一定来源包含有重组质粒的细胞。这些菌落可用于筛选特定的目的DNA（如使用免疫技术）。

PUC系列质粒比pBR322系列质粒的应用更广泛，这种质粒具有以下优点：

1. 拷贝数：每个细菌细胞中存在着几千个相同拷贝的质粒，提高了质粒DNA的产量。

2. 重组子的“一步选择”：这种质粒携带有氨苄青霉素抗性基因，并在β-半乳糖核苷酶的基因含有一个多克隆位点。β-半乳糖核苷酶基因的插入失活可以被包含有一种合适的酶诱导物（如异丙醇基硫代半乳糖苷）和生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（Xgal）的琼脂培养基检测到。来源于有质粒的细胞的菌落呈蓝色，而含有重组分子的菌落呈白色。另有一些质粒使用不同的标记物，如荧光素酶基因可以在荧光素底物的存在下通过生物发光检测到。

大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记，包括氨苄青霉素抗性（Ampr）、卡那霉素抗性（Kanr）、四环素抗性（Tetr）、链霉素抗性（Strr）和氯霉素抗性（Cmlr））等。

i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）是青霉素的衍生物，通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。细菌质粒Amp
r基因编码b-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的b-内酰胺环。

ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。细菌抗性原理是Cml
r编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。

iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌。而Kan r
编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。

iv）链霉素（Streptomycin，Str）通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌。Str
r编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。
v）四环素（Tetracycline，Tet）通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。Tet r 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。
抗生素抗性筛选原理是：不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长

---

迪庆藏族自治州15332007870： 利用质粒抗生素筛选标记进行转化子筛选的机理 - ？
单鹏凡乐： 大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记,包括氨苄青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四环素抗性(Tetr)、链霉素抗性(Strr)和氯霉素抗性(Cmlr))等.i)氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)是青霉素的衍生物,通过干扰细菌细胞...

迪庆藏族自治州15332007870： 基因工程中 如何用质粒上的抗生素抗性基因筛选重组子? 如果说一个质粒是空质粒 另一个插入了外源DN - ？
单鹏凡乐： 一个质粒上有很多抗性基因,在插入外源DNA的时候破坏一个,就是插入到一个抗性基因中间,然后进行两种抗生素检验就好了

迪庆藏族自治州15332007870： 如何检测阳性克?pbr322质粒为载体克隆基因过程,如何检测阳性 ？
单鹏凡乐： 质粒载体pBR322具有两种抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因,可供转化子的选择标记.把连接转化后的菌体培养物涂布在含有氨苄青霉素和四环素抗性的平板上倒置培养12~16h,长出来的单菌落进行PCR验证和酶切验证,验证为阳性的转化子再送去测序确认正确.为什么用单酶切呢?连反了多麻烦啊.

迪庆藏族自治州15332007870： 抗生素可不可以筛选转基因的植物细胞 - ？
单鹏凡乐： 可以. 如:G418 用途:氨基糖苷类抗生素,类似庆大霉素.在细菌,酵母,原生动物,高等植物及哺乳动物这类原核或真核细胞中抑制蛋白合成.广泛应用于转化了含抗新霉素基因质粒的真核细胞的筛选. 详见:http://baike.baidu.com/view/676752.htm

迪庆藏族自治州15332007870： 基因工程中的质粒 - ？
单鹏凡乐： 质粒上的基因无需整合至核染色体上,也有一些宿主(如毕赤酵母),需先将表达载体线性化、一般情况下,就可以表达、替代等),是通过同源重组进行的,不一定非是核染色体上的基因1、目的基因拼接到表达载体(也就是含有表达元件的质粒)上,阳性转化子可以在含有相应抗生素的筛选平板上生长,再转化至酵母体内.整合的方式是随机的(插入. 4. 3、目的基因的检验与测定可以通过检测是否有目的蛋白表达的方法;也可以PCR验证,一般为抗性基因.只要符合表达的条件,转化至宿主菌内就可以表达,是独立核染色体之外的、标记基因是用来筛选阳性转化子的. 2

迪庆藏族自治州15332007870： 转化子筛选的原理是什么? - ？
单鹏凡乐： 抗性筛选,蓝白斑

迪庆藏族自治州15332007870： 基因工程中的质粒1,目的基因拼接到质粒上后要怎么表 - ？
单鹏凡乐： 1、目的基因拼接到表达载体(也就是含有表达元件的质粒)上,转化至宿主菌内就可以表达,是独立核染色体之外的.只要符合表达的条件,就可以表达,不一定非是核染色体上的基因. 2、一般情况下,质粒上的基因无需整合至核染色体上,也有一些宿主(如毕赤酵母),需先将表达载体线性化,再转化至酵母体内.整合的方式是随机的(插入、替代等),是通过同源重组进行的. 3、目的基因的检验与测定可以通过检测是否有目的蛋白表达的方法;也可以PCR验证. 4、标记基因是用来筛选阳性转化子的,一般为抗性基因,阳性转化子可以在含有相应抗生素的筛选平板上生长.

迪庆藏族自治州15332007870： 如何筛选和鉴定转化子 - ？
单鹏凡乐： 你没有说明具体是什么转化子,一般的重组质粒转化细菌鉴定就是提质粒,酶切检测目的片段,也可以用pcr检测,最保险的方法当然就是测序.