做基因敲除如何快速筛出阳性克隆？

生物养生学方面的论文。~

研究中医养生学，如果与西医的个体保健医学相比，首先引起我们注意的就是它的超稳定性，一个在《老子》、《内经》等古籍中已基本构成的体系竟沿用了两千多年而无重大的改变和发展，而在这两千多年中我们跨过了奴隶社会、封建社会、半封建半殖民地社会和社会主义社会数种社会形态。更让我们奇怪的是，当代中医养生文献对这种现象没有引起丝毫的关注和讨论，似乎社会变化对中医养生学不产生任何影响，或者说，中医养生学对一切社会通用。
　　如果我们认为社会环境对医学的发展至关重要的话，那么无需过分寻找根据，我们就可以肯定上述影响必然存在，而且在瞬息万变的现代社会更为显著。《养心要语》的养生观点是："斗一斗，瘦一瘦；让一让，胖一胖。"在营养匮乏的古代，胖是健康和幸福的象征，而在今天，人们却为如何减肥而发愁。因此，研究现代社会对古老的中医养生学产生怎样的影响，以及中医养生学如何适应这种影响而发展，肯定是必要和非常有用的，对中医养生学研究来说，它应该是以后一段时期的中心任务。本文的内容，正是作者对这一主题的初步探索。 　　一、古代社会和现代社会诸因素的变化 　　从医学革命角度来说，现代社会是指处于第二次卫生革命阶段的社会。在我国，第一次卫生革命虽未彻底完成，但从总体情况、从城市、从农村的长远趋势来看，完全可以说已进入第二次医学革命时期。
　　从中医养生学产生的古代社会到现代社会，与人体养生保健有关的诸因素有如下变化：
　　1.病因和病种：病因：从生物、环境因素─→生活方式因素（社会、心理因素）；病种：从贫困病（传染病、寄生虫病）─→文明病（心脑血管病、恶性肿瘤、慢性退行性病变、肥胖病、糖尿病、消化性溃疡等）。
　　我国城乡的前三种死因（心脏病、脑血管病、恶性肿瘤）已与发达国家相同，而这三种死因与生活方式的相关性分别为47.6%，43.2%，45.2%。
　　2.心理状态：从弛缓─→紧张。与古代社会相比，现代社会的脑力劳动增多、生活节奏加快、竞争性加强、信息量变大、生活和交通空间拥挤，人际关系复杂，这些都是造成现代人心理经常处于紧张状态的根源。
　　3.体力活动：从多─→少。随着工业革命、城市化、信息革命的发展，人们在生产、办公、交通中的繁重体力劳动被代之以"按钮式工作"，过着一种"惯于久坐的生活"。
　　4.营养：从不足─→过剩。加上体力劳动减少造成的营养消耗减少，使肥胖症、高血压、高脂血症、糖尿病、维生素过多症等有关疾病明显增多。
　　5.健康要求：从无病、长寿（生物学观点─→"不仅没有躯体的缺陷，而且要有完整的生理、心理状态和社会适应能力。"（WHO 定义）这是"生物医学模式"向"生物－－社会－－心理医学模式"转变的结果。
　　6.养生保健对象：从老年人为主─→老年、中青年并重。因为中青年在现代社会的作用和地位提高、现代生活方式在中青年人身上最为突出、心身疾病年龄前移、同时老龄社会已成普遍现象。
　　7.欲望观：从禁欲─→享乐。对物欲、肉欲、情欲、精神欲望等的追求和享受已不再被看成是罪恶，而认为是应该的。与健康有特殊关系的烟、洒、毒品嗜好也泛滥成灾。
　　8.自然观：从顺应自然─→改造自然。现代社会对大自然的改造成绩，一方面给人类创造了不受自然因素干扰的良好生活环境。另一方面由于这种改造过于快和激烈，人类难于很快适应而影响健康，如电视病、空调病、电脑病、噪音和电磁危害、高楼恐惧症、星期一综合征、办公室综合征等。 　　二、社会变化对中医养生学的影响 　　从古代社会到现代社会诸因素的变化，使中医养生学的地位发生重要改变，在认识这种改变的基础上，制定相应的方针，可使中医养生学避开劣势，发挥优势，以固有的特点在现代社会的个人保健中产生更大的作用。
　　1.病因病种变化的影响：这种变化对中医养生学是有利的。中医养生方法有如下各类：调适四时、起居有常、慎七情、节欲、动功、静功、药物养生、食品养生、玩物养生。显然，这些方法都属于生活方式范畴，恰好针对了由不良生活方式引起的现代疾病。实际上，中医养生方法对古代社会的主要病种（传染病、寄生虫病）反而作用不大，因为它们主要是由环境，生物因素引起，必须以公共卫生来预防。
　　中医养生学必须：第一，发扬优势，致力于研究现代行为，如：看电视、狭小居住空间、求职、求学、办公室、竞争、出差、旅游等等。第二，改变不适应现代生活的行为养生法，如《内经》："春三月……夜卧早起，广步于庭，被发缓形，以使志生。"现代发式和居住空间都不适于此。第三，研究中医养生法对现代疾病的作用。
　　2.心理状态变化的影响：这种变化对中医养生学的影响是有利不利并存的。中医养生学主张精神应该弛缓，《道德经》："众人熙熙，如享太牢，如登春台；我独泊兮其未兆，如婴儿之未孩，儡（系字底）儡兮，若无所归"。《内经》："喜怒不节则伤脏"。一方面，这种养生法能对现代心理起调节平衡作用；另一方面，这种养生法在中医养生体系中是与生活态度联为一体的，这在现代社会中又行不通。
　　所以，第一，作为一种技术，中医养生学应对精神弛缓方法加以完善和扩大运用，如对运动员施以静功，使其加快恢复；在工厂中设精神松弛室，平衡工人的神经张力。第二，作为一种生活态度，中医养生学不应对此加以提倡。
　　3.体力活动变化的影响：这种变化对中医养生学是不利的。因为一般的中医养生体育方法都是低运动量的，如五禽戏、易筋经、气功、太极拳等，运动量大的武术则不列入中医养生学范畴，所以难以预防由运动量过少带来的现代疾病。
　　在不影响其它特色的情况下，可尽量加大中医养生体育的运动量。
　　4.营养变化的影响：这种变化对中医养生学也有和有利不利两方面。中医养生学是主张抑制食欲的，《饮食箴》："人身之贵，父母遗体，以口伤身，滔滔皆是，……因纵口味，五味之过，疾病蜂起。"《孙真人枕上记》："侵晨一碗粥，晚饭莫教足。"第一，这种观点方法对减少现代人的食量有正面作用。但第二，这种观点方法以牺牲人的饮食享受为代价，难以为现代人所接受。第三，它的典型表现－－素食对健康弊大于利。第四，中医养生方法运动量的不足又加剧了营养相对过剩。
　　必须寻找既能满足人的饮食享受而又减少营养摄入的饮食方法，同时加强中医养生体育的运动量。
　　5.健康要求变化的影响。这种变化对中医养生学不利。中医只强调心理平衡、忍让、无欲的消极一面，不提倡积极的心理，而且强调"出世"，把世俗之事看成妨碍健康的一大根源，《庄子》："夫恬淡寂漠，虚无无为，此天地之平，而道德之质也。""目无所见，耳无所闻，心无所知，汝神将守形，形乃长生。"《内经》："中古之时，有至人者，淳德全道，和于阴阳，调于四时，去世离俗。"
　　中医养生学应提高自己的健康标准，把社会中的人和人在社会中的活动作为研究对象，并把消极的心理状态看成健康心理状态的一个方面而不是全部。
　　6.养生保健对象变化的影响。这种变化对中医养生学有有利和不利两方面。中医养生学的主要对象是老人，这从中医养生方法的保守心理、慢节奏、低活动量上可看出来，专门的寿老论述在其体系中占有一半以上篇幅，对养生好坏的最主要标准是看其是否长寿，是否出现衰老征象。《内经》："余闻上古之人，春秋皆度百岁，而动作不衰。"又说，养生最好的真人，"寿敝天地，无有终时。"其次至人，也"益其寿命而强者。"其次圣人，"亦可以百数。"其次贤人，"亦可使益寿而有极时。"这在社会老龄化的今天是极为有用的，但对中青年养生就不甚适合。
　　中医养生学应结合现代老年人的特点如年龄更大，退行性病变多，子孙少，单独生活多，渴望参与社会等进一步完善老年养生方法。同时加强对中青年养生方法的研究。
　　7.欲望观变化的影响。这种变化对中医养生学有有利和不利两方面。中医养生学是全面禁欲的。《内经》："夫上古圣人之教下也，皆谓之虚邪贼风，避之有时，恬淡虚无，真气从之，精神内守，病安从来。是以志闲而少欲，心安而不惧，形劳而不倦，气从以顺，各从所欲，皆得所愿。故美其食，任其服，乐其俗，高下不相慕，其民故曰朴。是以嗜欲不能劳其目，淫邪不能惑其心。"这虽对现代人的某些过度纵欲有规劝作用，但以牺牲欲望享受代价来求得健康，难以为现代人所接受。其次，过度的禁欲实际上有碍健康。
　　中医养生学应该：第一，把禁欲看成是享乐的必要补充，而不是全部。第二，寻找有益享乐来代替不良纵欲。第三，研究对特殊不良嗜好如烟、毒、洒的戒除方法。
　　8.自然观变化的影响：这种变化对中医养生学有有利和不利两方面。中医养生学主张顺应自然。《道德经》："人道地，地法天，天法道，道法自然。"《吕氏春秋》："故古之治身与天下者，必法天地也。"这种方法能为人类在自然环境急剧受到改变，难以迅速适应的情况下，提供心、身的平衡。但同时，改造自然对人类健康利多于弊，它是必然的进程，而须应自然只起补充、调节作用。
　　中医养生学应研究各种适应不良病症，用顺应自然方法加以预防；同时，改变"自然"一词的含义，对新的自然──人造环境进行研究。并摒弃那些由于环境改变而变得不切实际的顺应自然养生法。
　　如果要对中医养生学的特征做出概括的话，消极和封闭是恰如其分的词汇。古代社会文化也是消极、封闭的，现代社会文化则是积极、开放的。这样，中医养生学与古代社会文化、古代健康要求是同一的，是相互相成的关系，养生方法、观念可用于做人、学问、政治之中。而中医养生学与现代社会文化、现代健康要求是互补的，是相反相成的关系，养生方法、观念不能用于生活、学习、工作之中，在保健中也不占主导地位，只是起平衡作用。这就是中医养生学在现代社会中总的地位。
　　中医养生学要在现代社会中适应新的地位，主要是靠发挥固有优势，而不是靠变缺陷为新的优势。这是因为能够克服中医养生学缺陷的新养生学──西医的个人保健学已在迅猛发展。这种情况下，中医养生学只能追求与西医个人保健学的互补而不应追求自身完备。　　本文的主题是，中医养生学"以不变应万变"的态度是应该改变，我们研究的对象应该是社会现实而不是古籍，在这里，只出世不入世的养生观点是不适用的。至于具体的观点，本文只起抛砖引玉的作用。参考文献 【1】中国健康教育研究所　开拓健康之路（上卷）　1987
【2】林乾良等　养生寿老集　上海科技出版社　1982 还有一些参考的http://www.docin.com/p-11096969.html

挺好啊，可以增长自己的知识还可以帮助别人

通过病毒法，化学转染法或电转法将gRNA和Cas9转入细胞中，根据转染方法不同进行不同时长的药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证，筛选出基因敲除的阳性克隆。

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华池县19267514198： 筛选阳性克隆的方法和原理?我需要至少两种方法和原理,两种. - ？
尹俗美抒：[答案] 最常见的就是蓝白斑筛选,详细的楼主可参考这个http://baike.baidu.com/view/161221.htm 方法很多,除蓝白斑筛选外,像 菌落PCR验证:详见http://baike.baidu.com/view/4118663.htm 从细菌里提取质粒后双酶切验证:用构建重组质粒时的两种限制...

华池县19267514198： 基因克隆筛选的几种方法和相关的技术特征有哪些 - ？
尹俗美抒： 这是一套通用方法,简单方便.利用目的基因筛选就要考虑各种情况,很麻烦:能否顺利表达(克隆载体不表达,原核真核,修饰定位、辅因子等等);是否便于筛选(抗生素筛选很方便,如果目的基因是酶、转录因子或结构蛋白,怎么筛选?);不能通用(每研究一种蛋白,就要换一种载体/宿主/筛选方法)...

华池县19267514198： 什么叫阳性克隆筛选法? 请打击帮帮忙!! - ？
尹俗美抒： 这是一种分子生物学的方法. 比如,在大肠杆菌中导入一个目的基因,要怎样才知道有没有导入进去呢?所以要同时导入一个报告基因(目的基因和报告基因位于同一个载体上).导入了报告基因的大肠杆菌在含抑制性物质的培养基上就可以生长,而不含报告基因的大肠杆菌(就是转化失败的)就不能生长.这样过了两三天后,在培养基上看见的菌落就是阳性科隆.这一过程就是阳性科隆筛选.一般选用的报告基因像青霉素抗性基因,链霉素抗性基因等等. 如果还想了解得更详细,就去买本分子生物学实验书或入门书籍看看就明白了.

华池县19267514198： 基因克隆中蓝白斑筛选法筛选阳性克隆的原理. - ？
尹俗美抒： 蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法: 是根据载体的遗传特征筛选重组子,如α-互补、抗生素基因等.现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息.在这...

华池县19267514198： 简述基因克隆的基本步骤 - ？
尹俗美抒： 1. 扩增目的基因,比如通过PCR的方法. 2. PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒. 3. 转染大肠杆菌 4. 筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法,就是在载体上,序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列,如果不被破坏,产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物,形成蓝色产物.如果有目的序列插入,这个酶就不能表达,形成的克隆就是白色的.5. 挑取阳性克隆,测序确认无变异和方向后,扩增质粒,提纯质粒.

华池县19267514198： 如何从基因文库中筛选目标克隆？
尹俗美抒： 你的cDNA文库不是保存在宿主里吗?以前的方法是做大量的平板,然后用原位杂交的方法去筛选阳性的克隆,多筛几次就好了,但做平板其实很累的. 现在的方法可以用RACE钓取全长的cDNA.关于RACE,你可以咨询试剂公司,有现成的试剂盒和方法可用.

华池县19267514198： 筛选阳性克隆 - ？
尹俗美抒： BamH 1 的酶切位点在tet上,所以酶切重组后,质粒就不会再表达四环素抗性抗性了,筛选阳性克隆要挑选在Amp平板上生长的菌株,而在Tet平板上生长的菌株是插入失败的.

华池县19267514198： 如何进行重组DNA阳性克隆的鉴定 - ？
尹俗美抒： 首先,要了解重组DNA的大小; 然后选择引物进行PCR; 最后跑电泳,看在相应位置是否存在DNA带.

华池县19267514198： 克隆未知基因的方法有哪些? - ？
尹俗美抒： 克隆方案(以拟南芥为例)(1)建立拟南芥诱变群体.采用拟南芥的化学诱变方法进行诱变处理:将约250mg野生型拟南芥种子用乙基甲磺酸(EMS)处理,得到M2代种子,供突变体筛选使用.该方法的优点是诱变率较高,操作过程比较简单...

华池县19267514198： 怎样确定一个基因是否被敲出？
尹俗美抒： 很简单,直接以靶基因的敲除位点为模板做PCR,如果是阴性,就是敲除成功.或者是提RNA后做RT-PCR.由于基因敲除往往不是敲除的整段基因,所以引物设计的时候要针对敲除的那个部位. 楼上说的只能表明外源基因的进入,但不能证明目的基因已经被去掉了.