rtPCR的作用
原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。
用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
扩展资料
反转录酶的选择
1、Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。
2、禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。
3、Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4、MMLV反转录酶的RNase H突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
参考资料：百度百科——RT -PCR
原理：RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real timePCR）共同的缩写.逆转录PCR,或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形.在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增.
步骤：（一）预变性：
破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构.使DNA充分变性,减少DNA 复杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组来源的DNA模板,最好不要吝啬这个步骤.此外,在一些使用热启动Taq酶的反应中,还可激活Taq酶,从而使PCR反应得以顺利进行.
（二）变性--退火--延伸循环：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链.（三）PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟。
PCR实验主要采用SYBR Green染料法和Taqman探针法，BIOG技术采用经化学修饰的热启动聚合酶，有效避免了非特异扩增，具有高度的特异性。反应缓冲液经多次优化，与热启动聚合酶具有最为乐观的搭配，使聚合酶的活性能够得到最大程度的发挥。反应灵敏快速，40个循环只需20多分钟的时间。在20ul的反应体系里，只要有几个拷贝的DNA分子就能被检测出来
ta连接和重组表达载体连接的区别
TA原理就是在做PCR的过程中，DNA聚合酶（Taq酶）在扩增完之后的3'末端总会多加一个带A的核苷酸，形成仅一个突出A的粘性末端PCR产物。 TA连接的原理就是: 扩出来带A的PCR片段与商品化的T载体进行连接。T 载体就是只有一个T核苷酸突出碱基的载体（目前T载体都已经商品化，只需购买就行了），这样...
为什么pcr产物可以直接连t载体
普通的taq聚合酶会在PCR反应过程中在3’末端加入一个碱基A，线性化平末端T载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基，从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提高了PCR产物连接和克隆的效率。
含粘性末端的目的片段能与T载体相连吗
T克隆的原理是基于常规PCR反应中所使用Taq聚合酶能够在PCR产物的3‘末端非特异性添加一个A,这样实际上常规PCR产物都含有3端突出一个A的粘性末端.基于这个原理,常规的线性T－克隆载体（PUC18和PUC19等）在其3’末端添加一个T,这样的载体能够和任何PCR产物进行连接克隆,并不需要添加任何特异性的粘性末端...
聚合酶链反应简介
8.1 基本原理 8.2 参与PCR反应体系的因素及其作用 9 聚合酶链式反应检查 9.1 聚合酶链式反应正常值 9.2 聚合酶链式反应临床意义 10 参考资料 这是一个重定向条目,共享了聚合酶链式反应的内容。 1 拼音 jù hé méi liàn fǎn yìng 2 英文参考 polymerase chain reaction [WS\/T 203—2001 输血医...
PCR的原理是什么 的原理是什么,它有什么用途
PCR全称多聚酶链式反应，原理是DNA的体外扩增。具体来说：在EP管里加入DNA、合成原料（dNTP、引物）、耐热的DNA聚合酶（taq）后，放入PCR仪，PCR仪会利用升温使DNA变性，在聚合酶的作用下使单链复制成双链，进而达到基因复制的目的。用途：1、核酸的基础研究：基因组克隆 2、不对称PCR制备单链DNA用于...
人类基因组计划的主要任务是什么?
实际上人类疾病相关的基因,也恰恰是人类基因组结构和功能完整性至关重要的信息。实际上在过去几年当中,对疾病的研究早已成为人类基因组研究 一个重要计划的组成部分。1997年提出了两个计划:一个是肿瘤基因组的解剖计划,还有一个叫环境基因组计划。实际上都是和健康相关的。人类基因组计划对医学的贡献,一个是在诊断...
什么是t载体
在基因操作中，T-DNA的一侧通常带有单个脱氧腺苷酸(A)，与PCR产物的A-T碱基配对，提高了克隆成功率。染色体是真核细胞内的遗传物质承载者，它们在细胞分裂时形成，是染色质高度折叠和压缩的结果。不同于染色质的普遍存在，染色体仅在细胞分裂阶段显现其独特的结构和功能，包括数量、大小和形态的多样性，...
T载体如何制备
有时需得到克隆化的DNA以便于杂交分析、高质量测序及从复杂PCR产物中分离目的片段。常用的方法有非定向克隆和定向克隆。定向克隆需在引物5′端引入限制性内切酶位点,PCR产物经适当内切酶酶切后产生粘端,连接到相应载体。非定向克隆有两种策略,一种是平末端克隆,在klenow和T4DNA聚合酶作用下修平PCR产物末端,...
TA克隆的定义是什么?
取自制的T-A克隆载体20 ng，按插入DNA片段与载体摩尔数之比(3∶1)的比例，在T4 DNA连接酶的作用下,在10～14℃连接48 h,然后转化于自制的DH5α感受态菌,在含X-gal\/IPTG的LB固体培养基上进行蓝白斑筛选并对抽提质粒后进行酶切鉴定.2 结果和讨论 对β-actin cDNA片段,从用T-A克隆载体进行克隆...
PCR产物片段链接到T载体上后,PCR片段是否会出现两种连接方向
PCR产物片段链接到T载体上后，PCR片段是会出现两种连接方向。如果用1%的琼脂糖电泳30min，主带（超螺旋的闭环质粒dna）会在3kb-2kbmarker之间，如果是单酶切产物，则应该在3.5kb的marker附近。要连接到载体上，形成带有PCR目标片段的质粒，将这个质粒导入受体菌，才能检测这个片段的活性、作用等等。摘要...
阴咽安博： 反转录酶聚合酶链式反应(RTPCR)用于以高精度、高效率的大量复制样品DNA.主要用于与分子生物,医学方面的DNA鉴定.
泰顺县17522193163： RT - PCR的原理是什么?有何用途? - ？
阴咽安博： RT-PCR有两种解释:1,最常用的理解:RT 是'逆转录'(reverse transcription)的缩写2,现在也有人这么用:RT是'实时'(real time)的缩写1,先说逆转录PCR:这项技术使用的'逆转录酶'来自逆转录病毒,是一种能按照碱基互补配对原则...
泰顺县17522193163： RTPCR(生物科学技术) - 搜狗百科？
阴咽安博：[答案] 1、核酸的基础研究:基因组克隆2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序3、反向PCR测定未知DNA区域4、反转录PCR(RT-PCR)用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA5、荧光定量PCR用于对PCR产物...
泰顺县17522193163： PCR的种类与作用分别是什么? ？
阴咽安博： 2.逆转录PCR(RT-PCR):以由mRNA逆转录而来的DNA为模板,由此产生出来的DNA不带有内含子(基因中不具意义的段落),常应用于分子克隆技术.
泰顺县17522193163： PCR技术有哪些用途 - ？
阴咽安博： 1、核酸的基础研究:基因组克隆 2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序 3、反向PCR测定未知DNA区域 4、反转录PCR(RT-PCR)用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA 5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控 6、cDNA末端快速扩增技术 7、检测基因的表达 8、医学应用:检测细菌、病毒类疾病;诊断遗传疾病;诊断肿瘤;应用于法医物证学
泰顺县17522193163： RTPCR的目的是什么?如果只想检测目的mRNA的量,还需做RTPCR吗? - ？
阴咽安博： RT-PCR,就是先把RNA反转录为cDNA,再PCR扩增. 如果只想检测某个基因mRNA的量,可以做northern blot, 或者定量RT-PCR(荧光实时PCR)
泰顺县17522193163： PCR,RT - PCR,实时荧光定量PCR的区别与联系 - ？
阴咽安博：[答案] 你所说的PCR应该就是最常规的PCR,以DNA为模板,通过上下游引物,实现DNA的扩增 RT-PCR一般情况下是指反转录PCR(reverse transcription),尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也(realtime fluores-cence quantitative PCR)也简称RT-...
泰顺县17522193163： 什么是RT - PCR? - ？
阴咽安博： RT-PCR简介 RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术.首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段.RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达...
泰顺县17522193163： 与其他分子生物学方法相比,用荧光探针RT - PCR法检测诺如病毒有什么优势? - ？
阴咽安博： 方法包括等温核酸扩增(NASBA)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光染料RT-PCR、荧光探针RT-PCR、多重RT-PCR等,是目前检测诺如病毒应用最广泛的方法,被称为检测诺如病毒的“金标准”. NASBA直接扩增RNA来进行检测...
