TUNEL检测的实验方法
1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20 min，再用二甲苯两次5~10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀。
2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30 min，几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2 h，但要结合你最终的背景着色。
4. DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30 min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。
5.PBS的充分清洗。我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。
6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。
南昌中洪博元技术部
a. 有些细胞或组织，例如平滑肌细胞或组织，nuclease或polymerase的酶活性水平较高，易导致出现非特异性的荧光标记。解决方法是，取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，以阻止这些酶导致假阳性。b. 使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液，导致出现假阳性。建议采用推荐的固定液。c. TUNEL检测反应时间过长，或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性荧光。注意控制反应时间，并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。 a. 支原体污染。请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。b. 高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。c. TUNEL反应过强。可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液稀释TdT酶2-5倍后再按照说明书操作。稀释后的TdT酶需当日使用。d. 红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。 a. 使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。b. 固定时间过长，导致交联程度过高。此时宜减少固定时间。c. 荧光淬灭。Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭。解决方法是需注意避光操作。d. 碘化丙啶双染时，如果碘化丙啶染色过深会导致观察到的本试剂盒的TUNEL染色效果减弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激发产生的荧光，从而起到淬灭作用。解决方法是用较低浓度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。
a. PBS或HBSS洗涤一次。
b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。
c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。
d. 用PBS或HBSS洗涤一次。
e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。
f. 转步骤5。 a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。
b. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水
平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。
c. 用PBS或HBSS洗涤一次。
d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。
e. 转步骤5。 a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。
b.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。
c. PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
d. 转步骤5。 a. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。
b. PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。
c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。
d. 转步骤5。 a. 用PBS或HBSS洗涤2次。
b. 在样品上加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。
c. PBS或HBSS洗涤3次。
d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。 a. 用PBS或HBSS洗涤2次。
b. 加入50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。
c. PBS或HBSS洗涤2次。
d. 用250-500μl PBS或HBSS悬浮。
e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范
围为515-565nm(绿色荧光)。
威霄丽珠： 原理 在细胞凋亡的过程中,基因组DNA会断裂产生双链、低分子量的DNA片段和高分子量的DNA片段,这些DNA链的缺口可以利用没标记法来识别.试剂盒就是通过催化DNA断端,来标记缺口.酶底物显色后,可以光镜检查被染色的细胞. 方法 TUNEL 试剂盒
若羌县19111688790： TUNEL检测的中文名称 - ？
威霄丽珠： 原位末端转移酶标记技术.凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口,产生一系列3′-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下,将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3′末端,从而进行凋亡细胞的检测.
若羌县19111688790： TUNEL方法检测凋亡的原理是什么 - ？
威霄丽珠： 细胞凋亡中染色体DNA断裂,DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3'-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL).
若羌县19111688790： 细胞凋亡的早期检测方法有哪些 - ？
威霄丽珠： 1、PS(磷脂酰丝氨酸)在胞外膜分布的检测 PS从胞膜内侧转移到外侧现象是在细胞凋亡的早期即可发生标志.AnnexinV是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,能专一性的结合暴露在胞膜外侧的PS,使用荧光素标记的AnnexinV 蛋白(如Annexin ...
若羌县19111688790： TUNEL细胞凋亡试剂盒说明书(罗氏、Promega中文版说明书等)及其实验步骤 - ？
威霄丽珠： http://www.promega.com.cn/techserv/ctbs/G3250TNUELFluo.pdf
若羌县19111688790： 细胞凋亡的诱导及检测实验,是一个设计实验,我想知道最简单的诱导剂及检测方法是什么? - ？
威霄丽珠： 诱导的话紫外光照比较简单 检测方法的话我个人认为扫描电镜最方便,TUNEL法和DNA片段化检测则比较常用
若羌县19111688790： TUNEL法检测细胞凋亡切片有什么要求 - ？
威霄丽珠： 没特别的,4u
若羌县19111688790： TUNEL细胞凋亡检测方法公司可以代做吗?怎么收费啊？
威霄丽珠： TUNEL细胞凋亡检测能做的公司比较多,主要看你什么显色了,如果DAB显色,一般的小公司就可以做,显微镜便宜.如果是FITC或者其他的显色就麻烦一点,不过你自己的城市如果不太偏,最好是找本地的实验室.关于收费的问题,如果自己提供试剂盒,公司单收一个实验室比较便宜,切片多的话大概20元一张.如果自己什么都不提供,一般收费在100元左右. 如果你订了试剂盒,你可以找你订试剂盒的公司,让他们给你做.或者让他们推荐一下.
若羌县19111688790： 细胞凋亡实验,用哪些方法测凋亡? - ？
威霄丽珠： http://www.bioon.com.cn/protocol/showarticle.asp?newsid=2722
