什么是分子标记技术？

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　　分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。

　　1. 1  第1 代分子标记

　　1.1. 1  RFLP 标记技术。

       1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术 。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。

　　优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。

　　缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区。

　　1.1. 2  RAPD 标记技术。

       为了克服RFLP 技术上的缺点,Williams等于1990年建立了随机扩增多态DNA Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技术,由于其独特的检测DNA 多态性的方式使得RAPD 技术很快 渗透于基因研究的各个领域。RAPD 是建立于PCR 基础之上的分子标记技术,基本原理是利用一个随机引物(8～10 个碱基) 通过PCR 反应非定点地扩增DNA 片段,然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA 多态性研究。对任一特定引物而言,它在基因组DNA 序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量和大小发生改变,表现出多态性。

　　优点：与RFLP 相比,RAPD 技术简单,检测速度快,DNA 用量少,实验设备简单,不需DNA 探针,设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析,不依赖于种属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,安全性好。

　　缺点：当然,RAPD 技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差,首先是显性遗传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂 ,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,安全性好。当然,RAPD 技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差,首先是显性遗传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂 ,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降;其次,RAPD 对反应条件相当敏感,包括模板浓度、Mg2 +浓度,所以实验的重复性差 。

1. 1. 3  AFLP 标记技术

      扩增片段长度多态技术(AFLP) ,又名限制片段选择扩增技术(Selective restriction fragment amplifi2cation ,SRFA) ,于1993 年由荷兰KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等发明,并已申请专利。AFLP 是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术,它将基因组DNA 用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补) 连接起来,并通过5′端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA 片段,从而形成指纹图谱的分子标记技术。AFLP 指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。

　　优点：它兼具RAPD 与RFLP 的优点,有较高的稳定性,用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点,并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染色体上,各染色体上AFLP 标记的数目与染色体长度呈正相关( r = 0. 501) ,而一对引物获得的标记涉及的染色体数与标记数呈正相关( r = 0. 826) 。因此,通过少量效率高的引物组合,可获得覆盖整个基因组的AFLP 标记 。目前,AFLP 作为一种高效的指纹技术,已在遗传育种研究中发挥它的优势。

　　缺点：不过也有研究认为,AFLP 对基因组纯度和反应条件要求较高,另外用于遗传作图时,少数的标记与图谱紧密度有出入。此外, 在RAPD 和RFLP 技术基础上建立了SCAR(Sequence characterize damplified regions ,序列特异性扩增区域) 、CAPS(Cleaved ampli2fied polymorphic sequence ,酶切扩增多态序列) 和DAF(DNA am2plified fingerprints ,DNA 扩增指纹) 等标记技术 。这些技术的出现,进一步丰富、完善了第1 代分子标记技术,增加了人们对DNA 多态性的研究手段。

　　1. 2  第2 代分子标记

1. 2. 1  SSR 标记技术。

       在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列,如重复单位长度在15～65 个核苷酸的小卫星DNA(Minisatellite DNA) ,重复单位长度在2～6 个核苷酸的微卫星DNA (Microsatellite DNA) 。小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以拷贝数不同,从而构成丰富的长度多态性。Moore 等于1991 年结合PCR 技术创立了SSR (Simple sequence repeat ,简单重复序列) 标记技术。SSR 也称微卫星DNA ,是一类由几个(多为1～5 个) 碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即(CA) n和(TG) n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同,导致了SSR 长度的高度变异性,这一变异性正是SSR 标记产生的基础。SSR 标记的基本原理:根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR 反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同,因而扩增出不同长度的PCR 产物,这是检测DNA 多态性的一种有效方法。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性,而且一般为共显性,因此是一类很好的分子标记。目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱。

　　优点：这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域。此外,SSR 标记不仅能够鉴定纯合体和杂合体,而且结果更加可靠,方法简单,省时省力。

1. 2. 2  ISSR 标记技术。

       ISSR 即内部简单重复序列,是一种新兴的分子标记技术。1994 年Zietkiewicz 等对SSR 技术进行了发展,建立了加锚微卫星寡核苷酸(Anchored microsatellite oligo nucleotides) 技术 。他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物,即在SSR 的5′端或3′端加上2～ 4 个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火,从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR 扩增。这类标记又被称为ISSR ( Inter2simple

　　sequence repeat ) 、ASSR(Anchored simple sequence repeats) 或AMP2PCR 。在所用的两翼引物中,可以一个是ASSR 引物,另一个是随机引物。如果一个是5′端加锚的ASSR 引物,另一个是随机引物,则被称为RAMP 技术[19] 。用于ISSR2PCR 扩增的引物通常为16～18 个碱基序列,由1～4 个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA 中SSR 的5′或3′末端结合,通过PCR 反应扩增SSR 之间的DNA 片段。

　　优点：SSR 在真核生物中的分布是非常普遍的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的ISSR2PCR 可以检测基因组许多位点的差异。与SSR2PCR 相比,用于ISSR2PCR 的引物不需要预先的DNA 测序,也正因如此,有些ISSR 引物可能在特定基因组DNA 中没有配对区域而无扩增产物,通常为显性标记,呈孟德尔式遗传,且具有很好的稳定性和多态性。

　　1. 3  第3 代分子标记

1. 3. 1  SNP 标记技术。

       单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism ,SNP) 被称为第3 代DNA 分子标记,是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异,这种差异包括单个碱基的缺失或插入,更常见的是单个核苷酸的替换,且常发生在嘌呤碱基(A 与G) 和嘧啶碱基(C 与T) 之间。SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异,被认为是应用前景最好的遗传标记。目前,已有2 000 多个标记定位于人类染色体上,在拟南芥上也已发展出236 个SNP 标记。在这些SNP 标记中大约有30 %包含限制性位点的多态性。

　　优点：检测SNP 的最佳方法是DNA 芯片技术,最新报道的微芯片电泳(Microchip electrophoresis) ,可以高速度地检测临床样品的SNP ,它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高10 和50倍 。SNP 与第1 代的RFLP 及第2 代的SSR 标记的不同有2 个方面:其一,SNP 不再以DNA 片段的长度变化作为检测手段,而直接以序列变异作为标记;其二,SNP 标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳,代之以最新的DNA 芯片技术。

1. 3. 2  EST 标记技术。

       表达序列标签( Expressed sequence Tag , EST)是美国国立卫生研究院(National Institutes of Health ,NIH) 的生物学家Venter 于1991 年提出的。随着人类基因组计划的开展,EST 技术首先被广泛应用于寻找人类新基因,绘制人类基因组图谱,识别基因组序列编码区等研究领域,之后又被广泛应用于植物基因组研究。EST 是指在来源于不同组织的cDNA 文库中随机挑选克隆、测序,得到部分cDNA 序列,一个EST对应于某一种mRNA 的cDNA 克隆的一段序列,长度一般为150～500 bp ,只含有基因编码区域。

　　优点：EST可代表生物体某种组织某一时间的一个表达基因,所以被称之为“表达序列标鉴”;而EST的数目则显示出其代表的基因表达的拷贝数,一个基因的表达次数越多,其相应的cDNA 克隆越多,所以通过对cDNA 克隆的测序分析可以了解基因的表达丰度。目前构建cDNA 文库一般都使用试剂盒,方法成熟,而且飞速发展的DNA 测序技术,也使得进一步降低大规模DNA 序列测定成本成为可能 。

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南丰县18525746327： 分子标记 - 搜狗百科？
蔽慧骨疏：[答案] 也称DNA分子杂交,是用来快速,灵敏检测目标物有有无特定的DNA分子序列,比如用此技术可检测基因工程中目的基因细胞是否导入了目的基因,免疫细胞中有无AIDS.

南丰县18525746327： DNA分子标记技术和DNA条形码技术的区别 - ？
蔽慧骨疏： DNA分子标记技术和DNA条形码技术的区别 分子标记 (Molecular Markers) 是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接的反映.与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相...

南丰县18525746327： 分子标记有什么用?做分子标记的目的是什么?还有做分子标记要用到哪些东西? - ？
蔽慧骨疏： 分子标记 (Molecular Markers) 是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接的反映.与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比,DNA分子标记具有的优越性有:大多数分子标记为共显性,对隐性的性状的选择十分便利;基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的;在生物发育的不同阶段,不同组织的DNA都可用于标记分析;分子标记揭示来自DNA的变异;表现为中性,不影响目标性状的表达,与不良性状无连锁;检测手段简单、迅速.随着分子生物学技术的发展,现在DNA分子标记技术已有数十种,广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面.

南丰县18525746327： DNA分子标记技术有哪几类要说出它们各 - ？
蔽慧骨疏： 分子标记大多以电泳谱带的形式表现, 大致可分为三大类. 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术, 包括:(1) 限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphism, 简称 RFLP 标记); (2) DNA 指纹技术(DNA...

南丰县18525746327： 分子标记技术为什么要用两对引物 - ？
蔽慧骨疏： 分子标记是生物遗传标记的一种.通过引物设计的不同,用PCR的方法在生物的基因组DNA上扩增出相关条带,通过电泳、识别、分析,可用作生物遗传信息的研究. 分子标记种类有很多,第一代分子标记以RFLP为代表,是基于酶切位点的多态性开发的分子标记. 第二代分子标记以SSR为代表,是基于简单重复序列的多态性.第二代分子标记通过引物的特殊设计,能够扩增DNA上的相应位置的序列,根据它们的多态性,进行下一步分析. 第三代分子标记以SNP为代表,单核苷酸多态性.是基于高通量测序为基础的新一代分子标记技术.

南丰县18525746327： 分子标记的方法有哪些? - ？
蔽慧骨疏：[答案] 一、基于分子杂交技术的分子标记技术此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子,然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交,通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性.① ...

南丰县18525746327： 分子标记在遗传学上有什么应用价值 - ？
蔽慧骨疏：[答案] 分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质 主要用于遗传标记 如遗传图谱的构建、基因定位、基因克隆、物种亲缘关系鉴别及与人类相关的致病基因的诊断和分析

南丰县18525746327： 分子标记的技术展望 - ？
蔽慧骨疏： 分子标记技术已飞速发展,并被广泛应用于动植物的遗传研究中.分子标记中的已在玉米、大豆、鸡、猪等动植物育种和生产中有许多应用研究,主要集中在基因定位、辅助育种、疾病治疗等方面的应用研究工作,取得了一些应用成果.分子标记技术的开发是分子生物学领域研究的热点.随着分子生物学理论与技术的迅猛发展,必将研发出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子标记技术.而分子标记技术与提取程序化、电泳胶片分析自动化、信息(数据)处理计算机化的结合,必将加速遗传图谱的构建、基因定位、基因克隆、物种亲缘关系鉴别及与人类相关的致病基因的诊断和分析.图片为AFLP的银染检测结果

南丰县18525746327： 分子标记的应用领域 - ？
蔽慧骨疏： 基因组作图和基因定位研究 长期以来,各种生物的遗传图谱几乎都是根据诸如形态、生理和生化等常规标记来构建的,所建成的遗传图谱仅限少数种类的生物,而且图谱分辨率大多很低,图距大,饱和度低,因而应用价值有限.分子标记用于遗...