cDNA构建
构建cDNA的过程分为六个关键步骤:
1. 反转录合成cDNA第一链: 利用生物细胞的总mRNA作为模板，反转录酶催化，形成与mRNA互补的RNA-DNA杂交链。mRNA的提取首先通过RNA提取方法，如APGC法或NP-40，确保其完整性。
2. cDNA第二链合成: 可通过两种方法，一种是利用cDNA第一链的发夹环作为引物，另一种是RNase H修饰法保留mRNA5'端的顺序。
3. cDNA甲基化: 是对合成的cDNA进行必要的修饰，可能影响其功能和稳定性。
4. 接头连接: cDNA与载体DNA的连接，使用末端转移酶、Klenow片段或粘性末端连接技术完成。
5. 分离纯化: 通过Sepharose CL-4B凝胶过滤法，将cDNA从转化后的细菌群体中分离出来。
6. cDNA与λ噬菌体臂连接: 用于构建cDNA文库，将cDNA整合到λ噬菌体的载体臂中，形成基因文库。
构建cDNA文库的详细过程包括提取mRNA、纯化、合成cDNA、克隆到载体、转化细菌以及鉴定目标cDNA，整个过程旨在捕捉细胞的全部遗传信息。
扩展资料
DNA(Deoxyribonucleic acid)，中文译名为脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被称为“遗传微粒”。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由RNA与DNA进行一定条件下合成的，就是cDNA。
基因是如何构建人类的
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DNA的超螺旋与染色体结构
揭示DNA的奥秘：超螺旋结构与染色体构建 想象一下，DNA这根生命的丝线，就像电话线一般，经过精细的编织，形成了更为复杂的三级结构——超螺旋。这不仅仅是简单的螺旋叠加，而是双螺旋基础上的精巧设计，决定着染色体的形态和功能。二级结构的B-DNA B-DNA，DNA的典型二级结构，每10.4个碱基对绕一圈，...
什么是dna重组技术,实验室dna重组需要哪些步骤
基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究...
构建基因文库的目的和意义?
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基因表达载体的构建过程中必须遵循哪些原则?
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生物,如何计算可以构建多少种不同序列的DNA片段,是双链DNA?
一段DNA分子有4对碱基,则其能构成无数种不同的DNA分子。因为，DNA的长度很关键。DNA是由四种不同碱基的脱氧核糖核苷酸构成的，DNA链的长度不同，组成DNA双链的核苷酸种类也不一定。所以有无尽的DNA种类。例如.某DNA分子共有300对碱基,由四种不同的碱基构成,则这4种碱基可能构成多少种DNA? A.2的150...
基因工程的基本过程主要包括哪些?
① 化学合成法 该方法适用于已知核苷酸序列且相对分子质量较小的目的基因的制备。目前化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150~200bp, 而绝大多基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸片段适当连接并组装成完整的基因。目前成熟的全基因合成方法可以合成10~50kb长度的DNA片段。② 构建基因文库法...
【转载】三代基因组测序技术原理简介
(1)DNA文库制备 454测序系统的文件构建方式和illumina的不同,它是利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段,并在片段两端加上不同的接头,或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增,连接载体,构建单链DNA文库(图5a)。 (2)Emulsion PCR (乳液PCR,其实是一个注水到油的独特过程) 454当然DNA扩增过程也和illu...
DNA分子双螺旋结构的提出是在哪些前人的基础上提出的?
1951年2月，威尔金斯将富兰克林拍的一张非常精美的DNA的X光衍射照片在意大利举行的生物大分子结构会议上展示，一直对DNA有浓厚兴趣的沃森看到这张图时，断定DNA的结构是一个螺旋体。他打定主意要制作一个DNA模型。他把这种想法告诉了他的合作者克里克，得到了克里克的认可。沃森和克里克构建DNA分子结构模型的...
基因文库名词解释
1、提取基因组DNA：从待测生物样本中提取出基因组DNA是构建基因文库的第一步。提取DNA的方法有很多种，包括商业化的试剂盒和手工提取方法。根据样本类型和实验要求选择适合的提取方法。2、断裂基因组DNA：将基因组DNA随机断裂成大小不一的DNA片段，可以使用酶切酶或超声波等手段。酶切酶是一种能够识别...
丑毕八宝：[答案] cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合.经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头,连接...
成武县15399051283： cDNA文库必须满足什么条件?其构建包括哪些步骤? - ？
丑毕八宝：[答案] 条件:1 、要使用mRNA经过反转录PCR产生cDNA.2 、要进一步获得cDNA全长3 、加适当接头,连接到适当的载体内.4 、转化受体细胞,构建为cDNA文库.基本步骤包括:RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法...
成武县15399051283： 如何获得cDNA?需要哪些步骤? - ？
丑毕八宝： 以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA. 步骤的话应该与DNA复制过程类似,需要的原料是mRNA模板,四中脱氧核糖核苷酸,逆转录酶,还有能量,注意:这样获得的DNA片段不含非编码区序列.以下是专业回答一).构建...
成武县15399051283： 求教cDNA制备的一般方法RT,一般的步骤就行, - ？
丑毕八宝：[答案] 一、制备用于克隆cDNA的mRNA 1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN)法 2.磁珠法分离mRNA 注意:一般需要做mRNA完整性的检测(检查mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力、mRNA分子的大小等);如果用于制备cDNA文库则还...
成武县15399051283： 构建CDNA文库所需的酶有几种?是那些?谢谢(高中生)说的通俗点~ - ？
丑毕八宝：[答案] 反转录酶:以mRNA为模板反转录合成DNA. 限制性内切酶:酶切目的基因和载体,使其产生相同的粘性末端. DNA连接酶:连接目的基因和载体.
成武县15399051283： 在什么情况下需要构建cDNA? - ？
丑毕八宝： 需要表达和研究表达的mRNA时
成武县15399051283： 从RNA抽提到制成cDNA的全过程 - ？
丑毕八宝： 一).构建cDNA文库: 以生物细胞的总 mRNA 为模板,用反转录酶合成互补的双链 cDNA ,然后接到载体上,转入到宿主后建立的基因文库就是 cDNA 文库.1、mRNA的提取及其完整性的确定 1) 总 RNA 的提取 RNA 提取方法:APGC法或...
成武县15399051283： 怎样得到一种基因的cDNA,求具体步骤 - ？
丑毕八宝： 1. 首先,你要知道那种细胞有该基因的高表达. 2. 培养该细胞. 3. 提取总的mRNA. 4. 下面的步骤取决于你对该基因序列的知道情况.如果全序列已知,那就设计一对针对首尾的PCR引物,直接做RT-PCR,就可以得到全长cDNA了.如果只知道其中一段,那就先把mRNA用随机引物反转录为cDNA,建立cDNA文库.然后用已知的序列设计探针,在文库中寻找
成武县15399051283： 如何构建一个物种的cdna文库 - ？
丑毕八宝： 当反转录,或随机引物与聚T合成第一链互补的mRNA,mRNA和第二条链是相同的. 中国因此,如果对基因的RNA 5' - 3',所述第一链反向,第二链是阳性.
