pcr扩增实验中为什么最后再加酶啊
pcr扩增所用的试剂：
pcr扩增步骤：
1．细菌染色体DNA的提取（见上一组）
2．RAPD反应体系的配置（上图）
3·反应程序：将RAPD反应试剂加入EP管中 轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子。
打开PCR反应仪输入以下反应数据
· 94 摄氏度预变性5min
· 94摄氏度变性40s
· 40摄氏度退火40s
· 72摄氏度延伸1min
将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min
注意事项：
1、PCR反应体系中DNA样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。
2、为避免污染凡是用在PCR反应中的Tip尖、离心管、蒸馏水都要灭菌；吸每种试剂时都要换新的灭菌Tip尖。
3、加试剂时先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶。
4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。
5、引物条件首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。
一般引物是根据实验需要人为设计的，与目的基因互补，扩增后就成为产物的一部分。其次，PCR使用的聚合酶没有内切酶活性，无法切割扩增产物。
酶比较容易失活。即便是耐高温的taq酶，在常温状态下，也有一个最佳时间。先把其他物质加好，最后加酶，一般是考虑到这一点的原因。pcr实验室污染反应很慢吗
(一) 标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。?(二) PCR试剂的污染：...
pcr25ul反应体系
1、CR就是聚合酶链式反应.再外界情况下完成对核算片段的迅速合成；2、有两端引物,Taq DNA聚合酶，模板DNA，合成DNA的核苷酸；3、聚合酶链反应石蜡油PCR扩增时建议在混合物上面铺一层石蜡油,减少PCR过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失；4、DNA模板的不同和引物不同,以及其它条件的差异,多聚...
pcr外部质控有几条扩增曲线
pcr扩增曲线四个阶段。_cr扩增曲线四个阶段为：基线期，指数增长期，线性增长期，平台期。聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
2、为什么P+CR中未加入DNA解链及合成引物相关的酶?
在PCR反应中，依靠的是高温DNA解链变性，是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，双链变成单链，使核酸的天然构象和性质发生改变，但不涉及其一级结构的改变；引物不在PCR过程中进行合成，引物是预先合成好的，然后加入反应体系的参与扩增反应，所以不需要相关的酶。
图表示利用三CR技术扩增目的基因的部分过程,其原理与细胞内DNA复制类似...
A、基因扩增中引物通常是一小段DNA或bNA片段，从理论上推测，第二轮中含引物A的比例为s\/4，第三轮中占7\/中，A正确；B、由于题图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的两DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长；通过绘图可推知，第二轮中亦不会出现等长的引物，所以在第...
跪求请问谁知道大肠杆菌在保健食品中的标准值是多少?我可以向那里咨询...
7) 当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时,结果判断为阳性。 二.分子生物学检测 分子生物学的出现,为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。因此其特异性更好。加之 操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。自动化...
pcr循环数差多少算有差异
_扯__CR方法简介：?1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。_谀0謇┰龅耐保诒暌脖焕┰觥T_CR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量...
高保真酶pcr基因片段时,不同錺cr出不同长度,是什么原因
因为一般的高保真酶因为有外切酶的活性，虽然提高了保真度，但是扩增效率会降低，所以用Pfu的时候，往往需要扩增时间要比Taq酶长，Pfu Ultra好一些。但是都难免会碰到Taq酶P有条带，换成高保真酶，直接P可能没有结果，或者是条带很弱。Phusion最牛，保真度可能大概有Taq酶的50来倍，而且太强劲了，基本没...
从病灶中找解药!肿瘤缩小69%,爆火的TILs细胞疗法对肺癌、宫颈癌、卵巢...
结果显示，在14例多线治疗失败的实体瘤患者中，客观缓解率（ORR）为35.7%，其中4例（28.6%）部分缓解（PR），1例（7.1%）完全缓解（CR），8例（57.1%）疾病稳定（SD）。在宫颈癌患者中，ORR为45.5%，达到完全缓解（CR）的患者占9.1%，疾病控制率（DCR）达到90.9%。GT101在淋巴细胞清除和高...
cik有什么特点
实验证明，扩增出的CD3+CD56+细胞来源于CD3+CD56-T细胞，而非CD3-CD56+NK细胞。同时发现在CD3+CD56-的T 细胞中，除CD4+CD8-T细胞外，其余三种T 细胞亚群(CD4-CD8+、CD4-CD8-、CD4+CD8+)均可通过体外多因子培养而获得CD56分子的表达，而由于CD4+CD8+细胞和CD4-CD8-细胞在正常人外周血中含量极低...
纳翁雅森： 应为PCR扩增出来的是混合物,酶切回收后才基本是纯的目的片段. 载体一般不用PCR扩增,一般是质粒来源,也需要用切口一致的酶消化回收. 之后连起来就好了
容县15947533657： PCR的加样顺序是怎么样的? - ？
纳翁雅森： 水、buffer、镁、引物、模板、dNTP、聚合酶.一般来说镁、引物、模板、dNTP四个顺序无所谓,酶要最后加,水和buffer要先加.
容县15947533657： 做PCR反应为什么在循环结束后要有5min延伸反应? - ？
纳翁雅森： 做PCR反应为什么在循环结束后要有5min延伸反应 ------------------ 这个问题比较好理解,因为在循环结束后,体系中的taq酶可能很多正处于复制状态,如果此时降到室温,将会影响最终产率.所以再留出5分钟,以使正在复制中的taq酶能够复制...
容县15947533657： PCR扩增实验时试剂的加入为何要从少到多 - ？
纳翁雅森： 其实做PCR时,一般是先加水,然后buffer、mg2+、dntps、引物、酶,分装后再分别加模板
容县15947533657： 引物设计好后还要加酶切位点吗? - ？
纳翁雅森： 一般的PCR引物是不需要加酶切位点的,保护碱基是在需要加酶切位点的引物上加入的,加入保护碱基的目的,是为了使PCR产物在后续的实验过程中能够更有效的进行切割,当然有个别的内切酶不需要保护碱基就可以有效切割,但是一般的都需要加保护碱基,不同的内切酶需要的保护碱基的个数和种类也不同. 你所提到的是否可以直接按照文献上的引物序列进行订购,有的文献的引物是可以直接用的,但是也不能排除不能用的可能,为了避免浪费精力和财力,你在订购之前最好blast 一下
容县15947533657： 构建质粒载体中用PCR获得目的基因,其中涉及的引物为什么要加酶切位点?难道不论载体都要加酶切位点吗? - ？
纳翁雅森： 获得目的基因后一般需要将目的基因连接到质粒载体上,在引物上加酶切位点可以使后续的连接过程简单、可控.因为可在载体和目的基因上酶切产生相同的切口.也有不需要加酶切位点的T载体,但连接过程效率不高还会有反向的错误连接.
容县15947533657： PCR扩增的过程中DNA引物为什么最后不用被切掉? - ？
纳翁雅森： 一般引物是根据实验需要人为设计的,与目的基因互补,扩增后就成为产物的一部分.其次,PCR使用的聚合酶没有内切酶活性,无法切割扩增产物.
容县15947533657： PCR技术中的酶和引物只须加入一次,可以重复使用对不对 - ？
纳翁雅森： 你是指相对早期的PCR,发现了耐高温的聚合酶后,不需要每轮重新加入酶吗?现在的PCR,所有的东西都是刚开始加好,然后直接跑完整个程序.
容县15947533657： 为何生化实验中酶试剂总是最后加? - ？
纳翁雅森： 如果先加的话,酶就已经和底物开始反应了,从而达不到实验的目的
容县15947533657： 为什么使用Taq酶,添加各组分的顺序有什么讲究 - ？
纳翁雅森： Taq是最常用的PCR酶了,扩增速度较快,正确率也可以,用于纯模板扩增没有问题.(当然,也最便宜=.=)顺序基本没有讲究,最多就是Taq酶最后加,避免降解,也就是了.其实我们平时实验的时候也不是特别在意,都没问题的.
