贴壁细胞加trizol一定要冰上裂解吗
根据我们实验室所用的实验手册,组织的粉碎使用的是臼和杵(非专业实验器具,市场买的陶瓷的),而且是加入液氮来降温,在液氮的浸泡中进行的。液氮蒸发极快,并不会跟裂解液混合。用冰块不能够很好的冷却。用剪刀剪也不能够很好的粉碎。
不过如果楼主需要的蛋白在所取组织中大量表达,该蛋白本身较为稳定,楼主所需的量又不多,在冰上剪碎也不是不行,应该也提取得到。理论上组织离体之后就不应该暴露在室温,对于蛋白质的保存温度越低越好,所以建议楼主从剪碎到裂解液之后全程都要使用冰块。
trizol,我用的少,我用的比较多的是typhon(往圣的)。给你发个typhon的说明书吧。
OneShine Typhon Total RNA Extraction Reagent 总RNA提取试剂是一种可以用于动物、植物、微生物、病毒总RNA抽提的试剂,具有极强的细胞或病毒颗粒裂解能力,可在短时间内裂解各种生命形式的基本单位。本品含有能够有效抑制RNase的有机试剂,最大限度地减少总RNA的降解。用本产品提取的总RNA纯度高,不含基因组DNA,可以直接用于Northern blotting、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RT-PCR、poly(A)+选择、RNA酶保护分析以及构建cDNA文库等多种分子生物学实验。
经过本产品处理后,离心管中的液体分为三层,RNA在上层水相中,而中间层固体相和下层有机相中则分别包含DNA和蛋白质。因此可以对中间层和下层进行深度处理,以求获得总DNA和总蛋白;DNA的获取用乙醇沉淀即可,而蛋白质的获取则采用异丙醇沉淀法。
本产品操作简便快捷,可以在一小时内完成所有实验。
II运输与保存方法
采用冰袋运输4℃避光保存,有效期一年。保存时应封口密闭,不宜长时间暴露于空气中,以免产品遭到氧化而失效。
III注意事项
1.本产品中含有苯酚、β-巯基乙醇等有毒试剂,具有毒性和腐蚀性,操作时要做好保护措施并在通风橱内进行取用,不可掉以轻心。如果不慎接触皮肤或粘膜,应立即转移至通风场地并用大量的自来水冲洗或漱洗,必要时及时就医。
2.需自备氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC处理水等(本公司均有售),所有吸头、离心管、PCR管、玻璃容器等要用DEPC水处理或高温烘烤后才能使用,防止RNase对总RNA的降解(本公司均有售)。
3.样品用Total RNA Extraction Reagent匀浆后,如果不加入氯仿进行下游实验,先-70℃冻存,可保存一个月以上。建议抽提总RNA后尽快进行后续实验,短暂保存应放置在-70℃中,只能冻融一次。
4.过多的样本量可能会导致裂解不充分,使产物纯度降低和污染。在吸取上清液时,不可贪多和焦急,吸取后所剩上清液的液面距中间层至少有2mm以上,以免吸取到中间层导致DNA的污染,使后续实验出现假阳性。
V操作流程
RNA的提取
准备试剂
氯仿,异丙醇,75%乙醇,无RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)。
操作步骤
1.匀浆处理
a、组织:将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml Typhon;肝脏、脑等柔软组织用匀浆仪进行匀浆处理。然后加入1mlTyphon,反复轻柔吹打,直至溶液不抽丝,样品体积不应超过Typhon体积10%。
b、单层培养细胞:去除细胞培养基,PBS冲洗一次,直接在培养板中加入Typhon裂解细胞,每250px2面积加1ml,用移液器吸打几次,转移至1.5ml离心管,反复吹打,直至溶液不抽丝。Typhon的用量应根据培养板面积而定。Typhon加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c、细胞悬液:离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml Typhon,反复吸打直至溶液不抽丝。加Typhon之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃ 12000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除,取澄清的匀浆液进行下一步操作。
4.第一步每使用1ml Typhon加入0.2ml氯仿,轻柔振荡或吹吸15秒,室温放置3分钟。
5.2-8℃ 12000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色或淡黄色水相,中间为固相。RNA主要在水相中,水相体积约为所用Typhon试剂的60%。
6.把水相转移到新管中(如要分离DNA和蛋白质可保留有机相),用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml Typhon加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
7.2-8℃ 10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
8.用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml Typhon至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟,弃上清。
9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,不要晾得过干,否则不易溶解,大约晾5-10分钟。加入25-200μl无RNase的水或0.5%SDS(本公司均有售),用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解。-70℃保存。
RNA的提取注意事项
1.从少量样品(1-10mg组织或102-104细胞)中提取RNA是可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800μl Typhon匀浆样品,离心取上清液后,异丙醇沉淀RNA前加5-10ug RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml不影响第一链的合成,也不影响PCR反应。
2.匀浆后加入Typhon,加氯仿之前样品可在-60—-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可保存在75%酒精中2-8℃一个星期以上或-5—-20℃一年以上。
3.分层和RNA沉淀时也可使用低速台式离心机,2600×g离心30-60分钟。
RNA的提取常见问题分析
得率低:
A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65:
A.检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高。
B.样品匀浆时加的试剂量太少。
C.匀浆样品时未在室温放置5分钟。
D.吸取水相时混了有机相。
E.RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解:
A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.细胞在胰酶处理时过度
D.溶液或离心管未经RNase去除处理
E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5
DNA污染:
A.样品匀浆时加的试剂量太少
B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液
蛋白聚糖和多糖污染:
沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染,步骤7中,每使用1mlTyphon在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心,加入以上操作步骤。
DNA的分离
准备试剂
乙醇、0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)、75%乙醇、8mM NaOH
操作步骤
1.样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTyphon加0.3ml无水乙醇混匀,室温放置3分钟,2-8℃不超过2000×g离心5分钟。
2.移去上清,(如需要分离蛋白质,可保留,进一步操作见后)用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTyphon加入1ml柠檬酸钠,室温放置30分钟,2-8℃2000×g离心5分钟,弃上清,重复一次。
3.用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀,每使用1mlTyphon加入1.5-2ml75%乙醇,室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-8℃2000×g离心5分钟,弃上清。
4.室温放置晾干DNA5-15分钟,用8mMNaOH溶解DNA。从50-70mg组织或10细胞中分离的DNA溶于300-600μl8mMNaOH,DNA的浓度通常为0.2-0.3μg/μl。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中,建议用弱碱溶解,8mMNaOH的pH值为9,溶解DNA后可用TE、HEPES调节pH。从某些样品(尤其是组织)中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物,可>12000×g离心10分钟除去。
DNA的定量
取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。理论上,人、大鼠、小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量约分别为7.1μg,6.5μg,5.8μg。
分离DNA的应用
1.用于PCR 溶于8mMNaOH的DNA用0.1MHEPES调pH至8.4,取0.1-1μgDNA用作PCR模板。
2.酶切反应 用HEPES或1mMEDTA调节pH至适当值。每μgDNA使用3-5单位的酶,酶用量为3-5 IV/mgDNA。
DNA分离注意事项
1.DNA在中间层和有机相中时可在2-8℃保存过夜。
2.DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存数月。
3.DNA在8mMNaOH溶液中4℃可放置过夜,如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM可置于4℃或-20℃长期保存。
DNA的分离常见问题分析
得率低
A.样品匀浆和裂解的不彻底
B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解
A260/A280<1.70
A.检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE中
B.酚除去不彻底,可用0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)再洗一遍DNA沉淀。
DNA降解
A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪
RNA污染
A.氯仿分层后水相未完全去除
B.DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)洗脱不彻底
蛋白质的分离
准备试剂
异丙醇、含0.3M盐酸胍的95%乙醇、无水乙醇、1%SDS
操作步骤
1.取沉淀DNA后剩余的上清,用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1mlTyphon加1.5ml异丙醇,室温放置10分钟,2-8℃12000×g离心10分钟弃上清。
2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTyphon加2ml洗涤液,室温放置20分钟,2-8℃7500×g离心5分钟,弃上清,重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。
3.真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟,用1%SDS溶解蛋白质,反复吸打,50℃水浴使其完全溶解,不溶物2-8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Westernblot或-5--20℃保存备用。
蛋白质的提取注意事项
1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5--20℃一年以上。
2.用0.1%SDS在2-8℃透析三次,10000×g离心10分钟取上清即可用于Western blot。
蛋白质的提取常见问题分析
得率低:
A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解
蛋白质降解:
组织取出后没有马上处理或冷冻
电泳时条带变形:
蛋白质沉淀洗涤不充分
1) 倒出培养液,用1×PBS 清洗一次。
2) 按每10 cm2 生长细胞加2 mL TRIzol,水平放置片刻,使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞,用移液枪吹打细胞使其脱落(对于贴壁牢固的细胞用细胞刮刮离表面)。
3) 将裂解液及细胞转移至一离心管中,用一次性注射器反复抽打直至裂解液清澈透明不粘稠。
4) 在15~30℃放置5 min1) 向裂解液中加入氯仿,盖紧离心管盖,用力震荡离心管(溶液充分乳化,成乳白状,无分相现象),在15~30℃放置3 min(由于氯仿沸点低、易挥发,振荡时离心管可能爆开,小心)。
2) 于4℃,12000 g,离心15 min(加速度:减速度=9:1)。
3) 从离心机中小心地取出离心管,吸取体积约为TRIzol 试剂起始加入量一半的上清至另一无RNA 酶的离心管(切忌吸动白色中间相)。
4) 向上清加入异丙醇,轻轻颠倒离心管充分混匀液体,在15~30℃放置10 min(如果没有明显沉淀,可以-20 度过夜)。
5) 于4℃,12000 g,离心10 min(加速度:减速度=9:1)。
1) 小心弃去上清,缓慢地沿管壁加入75%乙醇1mL(切勿触及沉淀),轻轻颠倒洗涤离心管管壁,小
心弃去乙醇。
2) 再加入75%乙醇1 mL,在涡旋器上短暂涡旋(使沉淀悬浮于75%乙醇水中);于4℃,8000 g 离心
10 min。
3) 小心弃上清,短暂离心,用枪吸去所有上清,在超净工作台中干燥沉淀5 min 使乙醇挥发。
4) 加入适量的RNase-free Milli-Q,用枪吸取Milli-Q 水轻轻吹打沉淀,使其悬浮于Milli-Q 水中,50℃保温10 min,待RNA 沉淀完全溶解后,-80℃保存。
5) 一般来说,总RNA 沉淀应该快速地溶于Milli-Q 水中(正常的现象是,沉淀在Milli-Q 水中快速旋转并且同时溶解)。但是,某些RNA 沉淀,可能在悬浮于Milli-Q 水10 min 后仍有固体物存在,则于4℃,12000 g,离心10 min(加速度:减速度=9:1)后,转移上清至另一1.5 mL 离心管-80℃保存。剩余的固体物加入Milli-Q 水后也保存于-80℃。
6) 一般说来,用TRIzol 提取到的总RNA 中盐含量是比较高的,因此沉淀的洗涤非常重要。上清和管壁上残留的液体要尽量除去干净。
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