培养细胞如何提取mRNA，如何逆转录？
1 细胞总RNA的提取
1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司） 1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。
2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇15秒。
3）、室温静置2-3分钟后，12000 rpm，15 min，4℃，离心。然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。
4）、12000 rpm，10分钟，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4℃离心。
5）、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟， DEPC处理水20-30 ul加入，中枪打匀，55-60℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。
6）、电泳。
2 从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）
1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 ul。
2）、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用Tip打匀或用手弹匀。
3）、70℃水浴，3分钟（裂解RNA的二级结构）。
4）、20-30℃条件下，静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）。
5）、高速离心2分钟，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50 ul的上清在原管里。
6）、用Buffer OW2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟。
7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400 ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液。
8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100 ul热的（70℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟。
9）、为保证最大的 mRNA产量，可再次重复第8步。
10）、电泳。
RNA提取的原理就是核酸在异丙醇中的溶解度很低！其他步骤都是防止RNA降解和使RNA从细胞中溶出。
逆转录过程请看参考资料。
离心收集细胞。
可用0.5MLltrizol,振荡--- 100微升氯仿 ，剧烈振荡，分层静置，12000RPM台式离心机 4度 10分钟--------取80%上清 ，加500微升异丙醇，沉淀总RNA，12000RPM，4度，5分钟 ----弃上清，加1ML75%冰乙醇洗涤，12000RPM，4度，5分钟------倒去吸边，空气中干燥30分钟-------加20-50微升DEPC处理的消毒三蒸水，溶解，低温保存备用。如果不保留样本，可不用DEPC处理的三蒸水，用消毒三蒸水即可则进入逆转录。
另外液体的体积可按上述比例。
细胞总RNA的提取
1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司）
1
ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。
2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5
ml
EP管中，加新开的氯仿0.2
ml，轻摇15秒。
3）、室温静置2-3分钟后，12000
rpm，15
min，4℃，离心。然后取上清无色水相（约0.6
ml）到
EP管（DEPC处理过），加0.5
ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。
4）、12000
rpm，10分钟，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀），75%乙醇1.0
ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500
rpm，5
min，4℃离心。
5）、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟，
DEPC处理水20-30
ul加入，中枪打匀，55-60℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。
6）、电泳。
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从总RNA中分离mRNA（Oligotex
mRNA
Mini
Kit,Cat.no.:70022,
QIAGEN）
1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25
mg）到一个新的无RNase
的EP管中，用无RNase的水定容到250
ul。
2）、加入Buffer
OBB
250
ul,
Oligotex
Suspension
15
ul。用Tip打匀或用手弹匀。
3）、70℃水浴，3分钟（裂解RNA的二级结构）。
4）、20-30℃条件下，静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）。
5）、高速离心2分钟，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50
ul的上清在原管里。
6）、用Buffer
OW2
400
ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5
ml
EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟。
7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer
OW2
400
ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液。
8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100
ul热的（70℃）Buffer
OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟。
9）、为保证最大的
mRNA产量，可再次重复第8步。
10）、电泳。
RNA提取的原理就是核酸在异丙醇中的溶解度很低！其他步骤都是防止RNA降解和使RNA从细胞中溶出。
逆转录过程请看参考资料。
楼上说的是错的，逆转录出来的dna是唯一的，不可能有多种可能，因为一种基因的mrna是唯一的！这位同学应该多看看密码子的知识，扯了半天都是与题目无关的。
提取mrna、反转录的操作都是基因工程，但是问题在于：
这句话本身就是错的
！
一言以蔽之，肝脏细胞不表达胰岛素基因！胰岛素基因在肝脏细胞内不转录，没有mrna生成，所以无从提取，也无从反转录！这个实验设计就是失败的。
基因工程首先必须得在合适的标本下进行合适的操作。
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才旦江伸筋：[答案] 1 细胞总RNA的提取 1)、6孔板细胞(CNE-2)汇合度为90-100%时,取出无菌室,去其上清,用PBS洗两次后,每孔加TRIZOL试剂(Gibco公司) 1 ml,摇匀,无菌罩内消化3-5分钟(观察:液体变粘稠,细胞脱壁). 2)、将各孔内消化好的细胞裂解液...
越西县18683569305： 在材料上培养了细胞,想做PCR 试验,请教如何提取mRNA? - ？
才旦江伸筋：[答案] 把材料取出来,先用PBS冲洗材料2-3次,然后用0.25%胰酶在37度条件下消化材料30分钟,用吸管轻轻吹打溶液,目的是尽量将贴附在材料上生长的细胞吹打下来,然后收集溶液,如果细胞数量不多,可以再用PBS洗涤材料,洗涤溶液与上次收集...
越西县18683569305： 请教如何从培养细胞提取mRNA - ？
才旦江伸筋： 离心收集细胞. 可用0.5MLltrizol,振荡--- 100微升氯仿 ,剧烈振荡,分层静置,12000RPM台式离心机 4度 10分钟--------取80%上清 ,加500微升异丙醇,沉淀总RNA,12000RPM,4度,5分钟 ----弃上清,加1ML75%冰乙醇洗涤,12000RPM,4度,5分钟------倒去吸边,空气中干燥30分钟-------加20-50微升DEPC处理的消毒三蒸水,溶解,低温保存备用.如果不保留样本,可不用DEPC处理的三蒸水,用消毒三蒸水即可则进入逆转录. 另外液体的体积可按上述比例.
越西县18683569305： 怎样从总RNA中提取mRNA?原理是什么? - ？
才旦江伸筋： 大多数真核细胞mRNA的3'端通常具有由20-30个腺苷酸组成的polyA尾巴,寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核苷(OligoT)可以与之配对结合,这就是提取mRNA最基本的原理.具体到实验手段上,现在磁珠法、纤维素柱层析法都有在用. 磁珠法一般...
越西县18683569305： 怎样提取细胞核内的RNA - ？
才旦江伸筋： a. 植物组织:取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨,把粉末加入到1ml裂解液中混匀.b. 动物组织:取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液,用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理.c. 贴壁细胞:直接在培养板中加入裂解液裂解细胞,每...
越西县18683569305： 如何根据基因的转录产物mRNA来获取目的基因 - ？
才旦江伸筋： 可以通过逆转录的方法来推测目标基因,但是这种方法有很大的局限性,因为真核生物的基因含有内含子,其最初转录的mRNA要经过剪切才能成为成熟的RNA,因此逆转录得到的基因比原来的基因短. 基因(遗传因子)是遗传变异的主要物质.基因支持着生命的基本构造和性能.储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡过程的全部信息.环境和遗传的互相依赖,演绎着生命的繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程.生物体的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关.它也是决定生命健康的内在因素.因此,基因具有双重属性:物质性(存在方式)和信息性(根本属性).
越西县18683569305： 基因工程中做mRNA是如何获得的? - ？
才旦江伸筋： 你说的肯定是不知道剪辑组成了!那人工合成就不行了! 方法多了,亲和层析行! 鸟枪法也行!不需要大量的!我们先获得一个然后PCR就行了!
越西县18683569305： RNA提取方法有哪些 ？
才旦江伸筋： RNAgents总RNA提取系统 1)Promega有哪些系统用于提取总RNA及poly(A)+RNA? 2)RNAgents®总RNA提取系统的工作原理怎样? 3)RNAgents®总RNA提取系统的一般...
越西县18683569305： 用基因工程生产干扰素的具体过程 - ？
才旦江伸筋： 1. 设计合成干扰素基因的两端引物(完全的),每条引物内或5'-端最好有内切酶酶切位点. 2. 有药物诱导细胞,如佛波酯,使细胞表达干扰素升高. 3. 破碎细胞,提取细胞总mRNA. 4. 用逆转录试剂盒逆转录,把总mRNA逆转录成cDNA 5. 以...
越西县18683569305： 怎样从基因文库中提取目的基因 - ？
才旦江伸筋： PCR技术是DNA扩增技术,它能在比较短的时间内产生大量的DNA.在获取目的基因后才使用PCR技术.获得目的基因的方法:一、构建基因文库 提取总DNA.用限制性内切酶将总DNA切成小片段,连到质粒或噬菌体载体上,把这些质粒转化...
