荧光光度法

紫外可见分光光度法与荧光光度法的区别~

一、指代不同
1、可见分光光度法：通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
2、荧光光度法：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。

二、特性不同
1、可见分光光度法：具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，是生物化学实验中最常用的实验方法。许多物质的测定都采用分光光度法。在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与不同波长相对应的吸收强度。
2、荧光光度法：由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收的紫外-可见光波长和发射光的波长也不同，同一种物质应具有相同的激发光谱和荧光光谱，将未知物的激发光谱和荧光光谱图的形状、位置与标准物质的光谱图进行比较，即可对其进行定性分析。
三、作用不同
1、可见分光光度法：在定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况（吸收光谱），从中确定最大吸收波长 ，然后以此波长 的光为光源（单色光），进行吸光度A的测定，是朗伯比尔定律用于定量分析的首要条件。
2、荧光光度法：测量物质的荧光强度可对其进行定量测定。荧光分析法的特点是灵敏度高、选择性好、样品用量少和操作简便。
参考资料来源：百度百科-荧光分光光度法
参考资料来源：百度百科-分光光度法

　　利用荧光光度计测定环境中某些物质的方法叫荧光光度法.
　　荧光计较之荧光分光光度计的概念来的大.
荧光分光光度计属于分光光度计之一类，其它诸如红外分光光度计，紫外分光光度计等等。

分光是指利用光的色散原理采用分光计选择荧光所标示的物质（元素）进行测量。
　　荧光分光光度计测的是吸收光能量后处于激发态的分子发出的辐射（即分子荧光）。

方法提要

水样用高氯酸-硫酸-钼酸钠消化，再用盐酸将硒(Ⅵ)还原为硒(Ⅳ)。在酸性条件下，硒(Ⅳ)与2，3-二氨基萘反应生成有绿色荧光的4，5-苯并苤硒脑，用环己烷萃取，在激发波长376nm，发射波长520nm下，进行荧光光度法测定。

本法适用于海水、天然水中总硒的测定，若试样不经酸处理，可直接测定四价硒的含量。方法检出限为0.2μg/L。

仪器和装置

荧光分光光度计。

电动振荡器。

试剂

盐酸。

高氯酸。

硫酸。

去硒硫酸量取200mLH₂SO₄在搅拌下，徐徐加入200mL水中，加30mLHBr，混匀，置沙浴上加热至冒白烟。

氢溴酸。

氢氧化铵。

环己烷若有荧光杂质需重蒸馏提纯，用过的环己烷重蒸馏后可再使用。

EDTA溶液(0.2mol/L)称取37gEDTA二钠盐于250mL烧杯中，加适量水，加热溶解，冷却后稀释至500mL。

盐酸羟胺溶液(100g/L)称取10gNH₂OH·HCl于100mL烧杯中，用水溶解后，并稀释至100mL。

EDTA-盐酸羟胺混合溶液量取100mL0.2mol/LEDTA、10mL100g/L盐酸羟胺溶液，加水稀释至1000mL。

2，3-二氨基萘(DAN)溶液(1g/L)称取400mgDAN于500mL烧杯中，加400mL0.1mol/LHCl溶解，然后转入1000mL锥形分液漏斗中(漏斗颈部塞有脱脂棉)，在振荡器上振荡15min使其全部溶解。加入80mL环己烷再振荡5min，静置分层后，收集水相，弃去有机相，如此反复纯化数次，直至有机相的荧光强度降到接近纯环己烷的荧光强度为止。将纯化后的DAN溶液贮存于棕色瓶中，加入环己烷使其覆盖液面约1cm厚，置于冰箱中保存，有效期一个月。

高氯酸-硫酸-钼酸钠混合溶液称取7.5g钼酸钠(Na₂MoO₄·7H₂O)溶于150mL水中，加入200mLHClO₄和150mL去硒H₂SO₄，混匀。贮存于500mL试剂瓶中。

硒标准储备溶液ρ(Se)=0.40mg/mL称取0.1405g二氧化硒(SeO₂，纯度99.9%)于50mL烧杯中，用适量水溶解后，移入250mL容量瓶中，加0.1mol/LHCl至标线，混匀。

硒标准溶液ρ(Se)=0.100μg/mL用0.1mol/LHCl逐级稀释硒标准储备溶液配制。

甲酚红指示液(0.4g/L)称取40mg甲酚红于100mL烧杯中，加少量水及2滴(1+1)NH₄OH溶解，加水至100mL。

校准曲线

取6个50mL烧杯，分别加入0.00mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL和4.00mL硒标准溶液，加水稀释至约10mL，混匀。

加5mL混合酸溶液，在沙浴中加热消化至冒浓白烟，至溶液变黄(约2h)。取下冷却至室温，溶液恢复为无色，用水释至约10mL。加5mLHCl，将烧杯放在沙浴表面加热至溶液变黄为止。取下冷却至室温。

将溶液移到50mL比色管中，用少量水洗净烧杯，洗液并入比色管中。加5mLEDTA-盐酸羟胺混合溶液，4～5滴(0.4g/L)甲酚红指示液，用(1+1)NH₄OH或0.1mol/LHCl调节pH为1.5～2.0(粉橙色)，加3.0mLDAN溶液，摇匀，置沸水浴中加热5min取下冷却到室温。将溶液移入60mL分液漏斗中，用少量水洗涤比色管，洗液并入分液漏斗中。加3.0mL环己烷，振摇4min，分层后弃去水相。

将环己烷层从分液漏斗口到入1cm比色皿中，在荧光分光光度计上，以376nm为激发波长，520nm为发射波长，环己烷为参比，测定硒的荧光强度I_i。以荧光强度I_i-I₀(标准空白)为纵坐标，相应硒含量(μg)为横坐标绘制校准曲线。

分析步骤

量取5.00～50.0mL海水样，于50mL烧杯中加5mL混合酸溶液，在沙浴中加热消化至冒浓白烟，至溶液变黄(约2h)。以下按制定校准曲线步骤测定荧光强度I_w。同时测定分析空白荧光强度I_b。

由I_w-I_b查校准曲线得硒量，海水样硒浓度的计算参见式(78.30)。

注意事项

1)配制DAN溶液时应在暗处进行。

2)在沸水浴上加热5min后，用冷水冷却的时间控制在10min内。否则结果会稍偏低。

3)甲酚红指示剂有两个变色范围，当pH2～3时由红变黄，pH7.2～8.8时由黄变红。本方法中调节pH为1.5～2.0时至粉橙色，pH<1.5为桃红色。因此调pH时要注意颜色变化，必要时可用精密pH试剂确证。

4)玻璃器皿用HNO₃溶液浸洗2～3d，洗净后使用。

5)试样制备。海水样品用玻璃或塑料采样器采集，水样应及时经0.45μm滤膜(滤膜预先在0.5mol/LHCl中浸泡12h，用纯水冲洗至中性，密封待用)过滤，并用HNO₃酸化至pH<2，贮存于聚乙烯塑料瓶或硬质玻璃瓶中，再以聚乙烯薄膜袋包封样品瓶。

6)水样体积的校正。在量取测定水样之前向水样加入的试剂溶液超过1%体积时，按式(78.31)进行体积校正。

7)水样中硒含量低时，可增加水样体积至50mL，对测定无影响。

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平川区19770989612： 荧光光度法原理xiangxide - ？
郑点妇炎：[答案] 利用荧光光度计测定环境中某些物质的方法叫荧光光度法. 而荧光分光光度计是给与一个激发波长后,到达激发态,再发射光,所以检测的是物质发射的光,检测信号与发射器不在一条线上. 分光是指利用光的色散原理采用分光计选择荧光所标示的物...

平川区19770989612： 荧光光度法与荧光分光光度法什么区别?还有分光是什么意思啊,谢谢 - ？
郑点妇炎：[答案] 利用荧光光度计测定环境中某些物质的方法叫荧光光度法. 荧光计较之荧光分光光度计的概念来的大. 荧光分光光度计属于分光光度计之一类,其它诸如红外分光光度计,紫外分光光度计等等. 分光是指利用光的色散原理采用分光计选择荧光所标示的...

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郑点妇炎： 实际上分光光度计的概念叫大,分光光度计还有紫外分光光度计,红外分光光度计等等.其主要是根据能量跃迁原理来区分.例如紫外分光光度计是测量物质经过紫外激发后物质可以吸收紫外光多少,测量的值是通过物质的光,检测信号与发射信号在一条直线上.而荧光分光光度计是给与一个激发波长后,到达激发态,再发射光,所以检测的是物质发射的光,检测信号与发射器不在一条线上.例如蛋白质,因为里面有酪氨酸、色氨酸的发色基团,一般的联苯结构,也就是可以形成ππ共轭体系的物质都可发射荧光.如果物质自身不带有荧光,则可以加入荧光探针.

平川区19770989612： 荧光光度法和分光光度法有什么不同啊?食品中有哪些(营养)物质可以用荧光光度法进行定量测定的?谢谢! - ？
郑点妇炎：[答案] 实际上分光光度计的概念叫大,分光光度计还有紫外分光光度计,红外分光光度计等等.其主要是根据能量跃迁原理来区分.例如紫外分光光度计是测量物质经过紫外激发后物质可以吸收紫外光多少,测量的值是通过物质的光,检测信...

平川区19770989612： 原子荧光分光光度法与分子荧光法的比较 - ？
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平川区19770989612： 从原理和仪器上比较紫外 -- 可见分光光度法与荧光分光光度法的异同点 - ？
郑点妇炎： 1.原理 相同点:吸光光度法和荧光分析法都是分子光谱. 不同点:吸光光度法是由分子对辐射能选择性吸收由基态或较低能级跃迁到较高能级产生的分子光谱,是分子吸收光谱;而荧光分析法是由分子对辐射能选择性吸收由基态跃迁到单重激...

平川区19770989612： 荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因 - ？
郑点妇炎： 因为与分子吸光光度法比较,萤光是从入射光的直角方向检测,即在黑暗背景下检测荧光的发射.分子吸光光度法中有入射光的背景干扰,因而分子荧光分析法的灵敏度通常比分子吸光光度法的要高2——4个数量级

平川区19770989612： 为什么荧光分光光度法比紫外灵敏度高 - ？
郑点妇炎：[答案] 是因为方法的性质不同: 【】紫外分光光度法是吸收光谱法;荧光分析法是反光分析法 【】发光强度不吸光强度要高扽多,所以荧光分析法比紫外分光光度法的灵敏度高出上千倍!

平川区19770989612： 为什么分子荧光光度分析法的灵敏度通常比分子吸光光度法高? - ？
郑点妇炎：[答案] 因为荧光分析法属于发光分析 只有待测物分子可以发出指定波长的荧光 紫外-可见分光光度法是吸光光度法 除待测物之外 其它物质也可能对入射光产生吸收 和波长没有关系 同学一场,给分吧~