冷冻电镜工作原理是怎样的?
说道冷冻电镜,全称叫做冷冻电子显微镜(CryoelectronMicroscopy),简单的说就是通过电子显微镜去观察冷冻起来的固体样本,然后得出清晰的三维结构。这项技术能够清晰的观察液体、半液体及对电子束敏感的样品,如生物、高分子材料等。那么今天小编就带着大家一起来了解一下冷冻电镜这项技术。
1. 什么是冷冻电子显微镜技术
冷冻电子显微镜技术,也叫冷冻电镜技术,是在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术,即把样品冻起来并保持低温放进显微镜里面,用高度相干的电子作为光源从上面照下来,透过样品和附近的冰层,受到散射。我们再利用探测器和透镜系统把散射信号成像记录下来,最后进行信号处理,得到样品的结构。冷冻电镜技术作为一种重要的结构生物学研究方法,它与X射线晶体学、核磁共振一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础。这项技术获得了2017年的诺贝尔化学奖。获奖理由是开发出冷冻电子显微镜技术(也称为低温电子显微镜技术)用于确定溶液中的生物分子的高分辨率结构,简化了生物细胞的成像过程,提高了成像质量。
2. 冷冻电子显微镜成像原理
在光学显微镜下,可见光穿过标本就会通过光学透镜进行折射形成图像。电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样,所不同的是电子显微镜采用电子束作光源,采用80-300kV电子束加速电压,用电磁场作透镜。两者的主要区别是分辨率不同,而影响分辨率的直接因素是光源的波长,即波长越短,分辨率越高。光子的波长大概在500nm左右。电子的波长是光子波长的十万分之一左右。1975年,Henderson通过电子显微镜首次解析得到了分辨率为0.7nm的细菌视紫红质的结构,这些开拓性的研究最终确定了细菌视紫红质以及其他膜蛋白,如水通道蛋白的近原子分辨率图。这些研究为许多二十面体病毒的原子分辨率模型的生成奠定了基础。非有机样品的分辨率甚至更高,它们在成像过程中承受的电子剂量比生物材料高得多,而且结构完整。
那么,为什么不能在原子分辨率的电子显微镜下,直接对单个蛋白质、病毒和细胞的自然状态进行常规成像呢?
在传统的透射电镜下,一般采用使用负染色法来减轻损伤,即在可接触的分子表面涂上含有重原子的试剂,如醋酸铀酰,这种试剂的辐射敏感性比有机物低得多。通常形成的细胞、病毒和蛋白质图像分辨率在2-4nm。对未染色标本进行高分辨率成像的困难在于,为了使损伤最小化所降低的电子剂量,会产生噪声图像,而电子剂量高到足以获得良好的信噪比时,则会导致标本损伤达到不可接受的程度。
为了解决上述为题,冷冻电镜技术采用了以下两种方法,第一种方法是使用保存在液氮或液氦温度下的冷冻标本进行成像。近40年来,对室温下衍射强度与低温下衍射强度衰减的测量表明,低温电子显微镜可以降低辐射损伤的影响。采用一种在一层玻璃态冰中快速冷冻(玻璃化)生物标本,然后在液氮或氦气温度下成像的方法,使得低温电镜技术得到广泛应用。将水溶液注入液氮冷却的乙烷等冷冻液中,是一种用于制备用于层析成像、单颗粒成像以及螺旋和二维晶体的冷冻电子显微镜样品的方法。与室温下相比,在液氮温度下成像可以减少多达六倍的辐射损伤。这意味着每单位电子剂量的辐射损伤减少,对于低温下记录的图像,可以使用更高的电子剂量来增加信噪比。事实上,液氮和液氦都被成功地用于近原子分辨率的三维重建,在它们的冷却下,分辨率可达大约0.4到2nm。第二种提高信噪比的方法是对大量同一生物标本单元的图像进行平均。该技术首次应用于螺旋组装体和二维蛋白晶体的室温成像及低温成像。这两个概念,即低温成像的概念和多幅低剂量图像平均的概念,构成了现代高分辨率生物电子显微镜的基础。
3. 冷冻电子断层扫描技术
电子断层成像通过获取同一区域多个角度的投影图来反向重构所研究对象的三维结构,适合于在纳米级尺度上研究不具有结构均一性的蛋白、病毒、细胞器以及它们之间组成的复合体的三维结构。虽然目前电子断层成像所获得的结构的分辨率(约4~10nm),但其在研究非定形、不对称和不具全同性的生物样品的三维结构和功能中有着不可替代的重要作用。冷冻电子断层成像的适用尺度非常广泛,包括从分子水平的蛋白质,到亚细胞水平的细胞器,以至细胞水平的组织结构。它有效地填补了X-射线晶体学、核磁共振以及冷冻电镜单颗粒分析等方法得到的高精度结构和光学显微镜技术得到的低分辨率的细胞整体图像之间的空白。
4. 冷冻电镜单颗粒技术
冷冻电镜单颗粒技术利用大量二维投影图像的数据,结合蛋白复合物在不同方向上的相同副本,对结构进行三维重建。和大多数其他低温电子显微镜应用一样,单粒子成像的第一步是将可溶复合物扩散到碳膜的孔上。然后标本被柱塞冷冻,形成一层薄薄的玻璃态冰,理想情况下,这层冰中含有不同方向的复合物的相同副本。冰层的厚度可能从几百埃到几千埃不等,受粒子的尺寸和缓冲区的组成的影响。从含有许多分子复合物的场的图像开始,通过人工或自动算法选择单个粒子。一旦选择统计方法,如主成分分析、多变量分析或协方差分析,可用于根据图像结构特征的变化对其进行排序。从分子复合体的二维电子显微镜投影视图生成三维重建依赖于所有粒子的相对方向。所涉及的步骤在数学上是复杂的,并利用了中心投影定理,该定理指出,对于一个三维对象,每个二维投影的傅里叶变换是通过该对象的三维傅里叶变换得到的一个中心切片(图5)。因此,通过获得数量足够大包含相对于电子束各种各样的方向的分子图像,可以建立3D图像(如图6所示,显示2D图像不同取向的GroEL用于获得其三维结构)。
5. 冷冻电子显微镜技术的突破
在最近几年,冷冻电镜技术的突破主要体现在三个方面。首先是样品制备,通过利用薄膜碳层甚至石墨烯可以用更薄的冰层包裹分子样品来提高信噪比。第二个突破是电子的探测技术,也就是电子探测器的发明。在300keV 电子的轰击下,传统的器件都会被高能量打坏,因此在电子探测器出现之前,冷冻电镜中使用的CCD相机需要将电子打在探测器上变成光信号,再通过CCD把光信号转成电信号后得到图像,电光—光电转换的过程降低了信噪比。而现在电子探测器能够直接探测电子数量,同时,互补型金属氧化物半导体(CMOS)感光元件的应用使得探测器支持电影模式(moviemode),可以在一秒钟之内获得几十张投影图片。通过后期对样品进行漂移修正,再把这几十张图片叠加起来,从而大幅提高成像的信噪比。模糊的图像一下子变得清晰,冷冻电镜的分辨率不断上升。第三个突破是计算能力的提高和软件算法的进步。冷冻电镜的模型重构通常需要对几万甚至几十万张投影图片进行分析、组装和优化。这需要先进的计算资源配合有效的算法才能实现。综上所述,冷冻电镜技术不仅提高了空间分辨率,而且可以应用于很多以前不能解决的生物大分子的结构研究。
冷冻电镜是什么?为什么能够斩获今年诺贝尔化学奖
冷冻电镜,是用于扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术(Cryo-SEM),可实现直接观察液体、半液体及对电子束敏感的样品,如生物、高分子材料等。能够斩获今年诺贝尔化学奖的原因是:诺奖委员会给出的获奖理由原话是“for developing cryo-electron microscopy for the high-resolution structure determination of ...
什么是冷冻电镜技术?
冷冻电镜技术,全称是冷冻电子显微镜技术,是在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术 这项技术获得了2017年的诺贝尔化学奖,获奖者有三位,分别是瑞士科学家Jacques Dubochet,美国科学家Joachim Frank,英国科学家Richard Henderson。冷冻电镜技术,是一种重要的结构生物学研究方法,它与X射线晶体学、核磁...
一般冷冻电镜需要做多久时间
一般冷冻电镜需要做真空冷冻干燥2小时。冷冻电镜技术,全称是冷冻电子显微镜技术,是在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术。冷冻电子显微镜技术是20世纪70年代提出的,80年代趋于成熟。它主要是研究生物物质结构的技术,与X-射线晶体学和核磁共振波谱学相辅相成,共同解析物质结构并且解决实际问题。
简述冷冻电镜技术及其在生命科学中的应用
冷冻电镜技术及其在生命科学中的应用如下:电镜技术在生命科学中的应用已有六十多年的历史,为生命科学在形态结构方面的研究带来了一场革命,突触(synapse)的发现就是一个典型的例子,它结束了自十九世纪末至二十世纪五十年代近半个世纪有关神经元之间是否有直接联系的神经生物学世纪之争。生命科学常规电镜...
冷冻电镜是如何观测到原子级别的生命结构的?
虽然负染的分辨率远达不到原子水平,但是其相对于光学显微镜来说分辨率已经很高了。所以,这一技术目前依然有着很广泛的应用,用于对样品质量的快速检测和样品结构的初步分析,是最主要的日常电镜生物结构分析手段之一。随着高压冷冻和冷冻替代技术的发展,负染色技术也是目前观察细胞或者组织样品的重要手段。
低温透射电镜和冷冻透射电镜的区别
快速冷冻制样技术能够保持住非平衡态结构,进而得以观察;③低温条件能够尽可能保持有机和高分子等软物质材料的微观结构,明显减少电子束对样品的损伤。冷冻电镜技术,是用于扫描电镜的很低温冷冻制样及传输技术。武汉低温透射电镜技术特点。【扫描信息测试信息】冷冻电子显微镜技术具有研究对象普遍、样品需求量...
冷冻电镜是什么,什么公司做的冷冻电镜最好?
冷冻电镜,是用于扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术(Cryo-SEM),可实现直接观察液体、半液体及对电子束敏感的样品,如生物、高分子材料等。为了观测蛋白质分子这类生物大分子的空间结构,研究空间结构与生物大分子的功能之间的联系,科学家们需要在真空环境下把蛋白质分子固定住。在这个指导思想下,科学...
“冷冻电镜技术”是什么?竟让研究它的物理学家,摘得诺贝尔化学奖_百度...
冷冻电镜用于扫描电镜超低温冷冻制及传输技术(Cryo-SEM)实现直接观察液体、半液体及电束敏品物、高材料等品经超低温冷冻、断裂、镀膜制(喷金\/喷碳)等处理通冷冻传输系统放入电镜内冷台
如何用冷冻电镜来研究动态结构
研究步骤如下:1、需要准备样品以便在冷冻电镜中进行观察。2、将样品迅速冷冻至极低温,是液氮温度或者更低,以防止冰晶的形成。3、将冷冻固化的样品放入冷冻电镜中进行观察。冷冻电镜使用电子束来照射样品,通过收集电子的散射模式来生成图像。4、使用冷冻电镜收集样品的图像数据。5、对采集到的图像数据进行...
涨知识丨冷冻电镜是什么?为什么能够斩获今年诺贝尔化学奖
获诺贝尔奖的“冷冻电镜”究竟是何方神圣?
阎治腺苷: 冷冻电镜,是用于扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术(Cryo-SEM),可实现直接观察液体、半液体及对电子束敏感的样品,如生物、高分子材料等.样品经过超低温冷冻、断裂、镀膜制样(喷金/喷碳)等处理后,通过冷冻传输系统放入电镜内的冷台(温度可至-185℃)即可进行观察.其中,快速冷冻技术可使水在低温状态下呈玻璃态,减少冰晶的产生,从而不影响样品本身结构,冷冻传输系统保证在低温状态下对样品进行电镜观察.过去,冷冻电镜虽然有以上优势,不过高能电子束打在样品上也会使其局部融化,影响拍摄.近期,随着高效探测器的研发成功和在电镜方面成功应用,提高了拍摄效率,电子束打在样品上,极短时间内就完成信号收集,完成拍摄,解决了冷冻电镜的发展瓶颈问题
朝天区19877758438: .什么叫冰冻断裂电镜技术 - ?
阎治腺苷: 冰冻断裂又称为冰冻断裂复型技术,是一种制备透射电镜样品的方法,多用于观察膜性结构的内部构造.先用液氮(-196°C)快速冷冻生物样品,防止形成冰晶.再将冷冻的样品迅速转移到冷冻装置中,并迅速抽成真空.在真空条件下,用冰刀切割冰冻样品,使样品断裂露出两个表面.由于快速冷冻方法固定的生物样品具有刚性和脆性.在对其施加外力后,组织即在结构上结合最薄弱的部位发生“脆性断裂”,这就是“冰冻断裂”.对于生物膜,断裂沿膜内部疏水区发生,从而暴露出膜内部结构.利用金属投影和复型技术,制备断裂面的复型,然后将组织腐蚀掉,并用载网捞起复型膜,就可用电镜来研究组织断裂表面所显示的细胞膜或生物膜内部超微结构.
朝天区19877758438: 电镜在生命科学研究中的应用有哪些方面 - ?
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朝天区19877758438: 理查德·亨德森的故事 - ?
阎治腺苷: 理查德·亨德森(Richard Henderson),男,1945年出生于苏格兰爱丁堡,1962-1966在爱丁堡大学获得物理学学士学位. 1969年取得英国剑桥大学博士学位.分子生物学家和生物物理学家,电子显微镜领域的开创者之一.现为英国剑桥大学...
朝天区19877758438: 电子透射显微镜和电子扫描显微镜的区别是什么 - ?
阎治腺苷: 透射电子显微镜是用透过样品的电子束使其成像的电子显微镜,在一个高真空系统中,由电子枪发射电子束,穿过被研究的样品,经电子透镜聚焦放大,在荧光屏上显示出高度放大的物像,还可作摄片记录的一类最常见的电子显微镜 电子扫描显微镜是用电子探针对样品表面扫描使其成像的电子显微镜.应用电子束在样品表面扫描激发二次电子成像的电子显微镜.主要用于研究样品表面的形貌与成分. 透射电镜(全称:透射电子显微镜)是一个电子光学仪器.透射电镜包含大型透射电镜、低压透射电镜、冷冻电镜等,并拥有样品内部组织形貌观察、原位的电子衍射分析、原位的成分分析、表面形貌观察等功能.
朝天区19877758438: 细胞生物学中什么叫冰冻断裂电镜技术(分值:4分) - ?
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朝天区19877758438: 扫描电镜在生命科学中有哪些应用 - ?
阎治腺苷: 可以看到一些原子和分子,比如说看DNA分子,蛋白质分子的结构.
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阎治腺苷: 感染了人乳头瘤病毒怎么办? 人乳头瘤病毒是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属,是球形DNA 病毒,能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖.表现为寻常疣、生殖器疣(尖锐湿疣)等症状. 随着性病中尖锐湿疣的发病率急速上升和宫...
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阎治腺苷: 人教版8年级物理 第一章声现象 声现象 1、声音的发生 一切正在发声的物体都在振动,振动停止,发声也就停止. 声音是由物体的振动产生的,但并不是所有振动发出的声音都能被人耳听到. 2、声间的传播 声音的传播需要介质,真空不能传...
朝天区19877758438: 八年级上人教版物理章节目录 - ?
阎治腺苷: 第一章 声现象 一、声音的产生与传播 二、我们怎样听到声音 三、声音的特性 四、噪声的危害和控制 五、声的利用 第二章 光现象 一、光的传播 二、光的反射 三、平面镜成像 四、光的折射 五、光的色散 六、看不见的光 第三章 透镜及其应用 一、透镜 二、生活中的透镜 三、探究凸透镜成像的规律 四、显微镜和望远镜 第四章 物态变化 一、温度计 二、熔化和凝固 三、汽化和液化 四、升华和凝华 第五章 电流和电路 一、电荷 二、电流和电路 三、串联和并联 四、电流的强弱 五、探究串并联电路 的电流规律