western blot试验中遇到的问题，希望能帮到正在苦恼的你~
作者&投稿：车凭 （若有异议请与网页底部的电邮联系）
配缓冲液过程中，过硫酸铵最后加，防止出现过多气泡。
温度：温度越高凝固越快，胶通常在0.5-1h内凝固最好。充分凝固后可保鲜膜包裹4℃过夜，第二天使用。
跑胶前：蛋白浓度检测，浓度低可能是提取不成功。
转膜后：丽春红染色，正常的话可以看到很多蛋白条带。
显色后：内参及目的蛋白的检测。
1.考虑没有完全变性，适当提高SDS浓度，同时延长煮沸时间。
2.考虑蛋白浓度过高，加入缓冲液稀释。
1. 电压：低电压下筛选效应充分，条带漂亮。
2. 胶的均匀度：胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。
︶笑脸型：凝结冷却不均匀，中间冷却不好。
︵皱眉状：可能凝胶和玻璃板底部有气泡。
拖尾：样品溶解不好
纵向条纹：样品中有不溶性颗粒
条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散：加样量过多溢出
转移缓冲液加SDS（终浓度0.1%）；提高转移电压/电流；增加转移时间
使用0.22um 或0.1um 的NC膜；减少转移时间，30min足够。
我们用的是湿转法，效率比较高，如果目的蛋白很小，可以考虑半干转。
对于大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不用考虑过转情况，看条带对应的marker是否转上，即可确定自己的条带是否转上。如果没有，适当增加电压/电流，延长时间，还有避免胶和膜中间有气泡。
小分子量（<15kd）尤蛋白容易出现过转，同样丽春红染膜或观察marker即可确认有没有过转。
PVDF膜先置于甲醇中处理10 s，然后浸于电转缓冲液中10 min，再夹三明治。NC膜则不需要预处理。
我们用的是5%脱脂奶粉，10%TBS缓冲液配制。
正常情况，室温封闭1h即可。如果曝光背景过高，可以适当延长封闭时间至2-5h，也可以4℃过夜， 封闭时间过长并不会导致检测信号减弱 。
如果延长了封闭时间，背景还是高。考虑抗体浓度过高，可稀释使用；目的蛋白丰度太低，信号弱。
（静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层）
牛奶里面会有一些不悬浮的大颗粒，对封闭无益。可以在转膜开始之后配好牛奶，在充分搅拌好的前提下，静置于4℃。使用时不要担心牛奶不均而特意混匀，只吸上层部分完全ok。
提高蛋白上样量；适当增加封闭时间，延长一抗孵育时间；封闭的选择：5%脱脂奶粉？ 5%BSA？；磷酸酶抑制剂；样本低温操作，最好是新鲜样品，反复冻融易降解。
加大上样量，调整抗体比例，转膜效率。
降低抗体比例；封闭液中加去垢剂：吐温20；降低上样量；用其他蛋白做封闭液：5%BSA，serum；
样品可能存在降解；转膜不及时造成扩散。
史复巴利： western blot湿转时,一般是用恒压,当然恒流也可以,根据蛋白大小,正常的条件是80V,120分钟,如果分子量较小,可以恒流200mA,120分钟.具体使用条件可以根据western blot湿转效果再做调整. 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即...
海北藏族自治州15694268492： western blot 试验中蛋白转膜总转不上去 - ？
史复巴利： 当然,首先要考虑的问题是你转过头了,蛋白质跑出去了. 其次 你的电流有点大,你也没说转了多久?用的干转还是湿转? 是不是拿出来的时候很热?这种情况有可能使蛋白质降解. 我们一般是湿转用100mA转2小时, 干转所需电流更小.
海北藏族自治州15694268492： western blot 的内参不一致,急求助 - ？
史复巴利： 要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是Western Blot.因为Western Blot操作相对简单方便,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化.虽然,顺利的时候Western Blot做起来...
海北藏族自治州15694268492： western blot 检测caspase - 3遇到问题,求解答 - ？
史复巴利： 定量的话肯定是选ELISA. Western blot只是一个半定量的实验方法.检测误差的话...楼主一是一定要选好合适的内参,比如可以测目标蛋白/总蛋白,则内参是总蛋白量,如果使用目标蛋白/总组织重量,则很不准确,因为抽提过程的效率不稳定,即每克组织能够提取出来的蛋白量不固定,而且每个组织含水/含不相干的组织量也不同.建议楼主参考相关文献来选择内参.二是最普通的查验误差的办法,每个试样多测几个孔.一般至少两个,三个更好.确定每个孔读数一致或非常相近,则知道结果比较可信.
海北藏族自治州15694268492： 做Western blot ,煮蛋白样,结果变成了黄绿色,怎么回事?做Western blot ,煮蛋白样,结果沉淀中的蛋白样品煮了1min后变成了黄绿色,怎么回事?有没... - ？
史复巴利：[答案] 可能loading buffer pH值偏离,我跑胶碰到过,没有什么问题 查看原帖>> 求采纳
海北藏族自治州15694268492： Western Blot 化学发光(ECL)为什么出现高背景? - ？
史复巴利： 做Western Blot发光实验经常有“背景太高”问题的出现,要弄清“背景太高”的原因,先要知道“背景”是什么,“背景”也是发光,影响发光的因素就会影响背景. 影响发光的因素主要有:1.含HRP的抗体;2.发光试剂;3.和发光试剂反应...
海北藏族自治州15694268492： western blot 一抗浓度高和低出现什么结果 - ？
史复巴利： 如果抗体亲和力低,适当提高一抗浓度,有助于结合.但是如果一抗是多抗,浓度过高,会导致非特异性结合,出现杂带.或者显色时候背景重.一抗浓度低的话,结合不好.
海北藏族自治州15694268492： 电泳实验中什么叫上样缓冲液?WESTERN BLOT 中需要进行电泳,其具体的各个缓冲液的作用是什么尤其是上样缓冲液 - ？
史复巴利：[答案] 楼上的博士啊,人家用的是蛋白上样缓冲液,不是核酸电泳缓冲液. PAGE分离蛋白所用缓冲液一般使用Tris,溴酚蓝以及甘油;也可使用TBE,加入溴酚蓝和甘油.还可加入少量DTT和巯基乙醇. 作用主要是标记和指示电泳程度,还有给试样染色,便...
海北藏族自治州15694268492： western blot中封闭起什么作用 - ？
史复巴利： western blot中封闭主要是起去除非特异性吸附的作用 在western blot转膜时,PVDF膜在甲醇活化后是带电的,因而在转膜时会将蛋白吸附.封闭的目的就是要将PVDF膜上无蛋白的部分空隙用奶粉填满,以免孵抗体的时候一抗二抗与之结合,产生非特异条带或者是背景杂乱. 所以western blot中封闭主要是起去除非特异性吸附的作用
海北藏族自治州15694268492： 求助western blot maker出现的问题 - ？
史复巴利： 可能的原因有, maker加的量少,半干法转膜的时候转缓液加多了,maker没有保存好,如长期放在室温分解了,也可能是跑电泳的胶的问题.跑胶的时候电压越小条带相对弥散些,不过还不至于maker不清楚.
